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sjjsy7银虫 (小有名气)
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[求助]
关于PFU酶扩增
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最近用PFU酶想克隆几个水稻基因，可是死活扩不出，先说一下我的体系吧 25ul体系 dd水14.75ul 10X PFU Buffer2.5ul dNTP1ul 引物0.5ul PFU酶0.3ul temp 1ul 退火温度55度，延伸2分钟 最后跑胶的时候连引物二聚体也没有，是不是引物不行啊，还有就是我下一步是接T载体，有人跟我说用PFU扩最后还得另外加A尾巴，Taq酶不用，到底是个什么情况？  还请哪位虫虫指点迷津！！！！！！！！ |
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chs4502
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你是要链接到T-载体中去的，用Taq或EX-taq会方便点。因为Taq酶会在你的目的片段末尾加上一个A，刚好和T-载体末端的T配对。而使用Pfu酶只能产生钝性末端，只能加上一个A以后才能与T-载体连接。 你P不出来的原因可能有以下几种： （1）引物的问题，可以用primer5.0检测一下； （2）退火温度的问题，建议跑个梯度。选择最合适的退火温度。pfu的退火温度比一般的taq酶的要低一点； （3）pfu在没有dNTP的情况下能使模板解链，因此需要最后加； （4）你的反应体系可以改良一下，dNTP可以提高到2ul，或者加入一点1%-5%的甘油，可以提高PCR产物的产量。 祝你实验顺利 |
19楼2012-10-26 18:17:35
shenye.judy
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2楼2012-07-17 19:19:49
3楼2012-07-18 08:48:33
123n
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4楼2012-07-18 10:14:24