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sjjsy7

银虫 (小有名气)

[求助] 关于PFU酶扩增

最近用PFU酶想克隆几个水稻基因,可是死活扩不出,先说一下我的体系吧
     25ul体系      dd水14.75ul     10X PFU Buffer2.5ul     dNTP1ul   引物0.5ul      PFU酶0.3ul   temp 1ul
         退火温度55度,延伸2分钟
     最后跑胶的时候连引物二聚体也没有,是不是引物不行啊,还有就是我下一步是接T载体,有人跟我说用PFU扩最后还得另外加A尾巴,Taq酶不用,到底是个什么情况?
        还请哪位虫虫指点迷津!!!!!!!!
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genegop

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-07-18 13:57:48
PFU的延伸速率比Taq慢,需要的时间是扩增片段长度(kb单位)×2(min)。如果你的扩增片段长度超过1kb的话,延伸2 min就不够,需要增加延伸时间。
另外,PFU有3'-5'外切酶活性,准备PCR体系时一定要最后加PFU,不然酶会切割引物。
6楼2012-07-18 12:10:19
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shenye.judy

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
amisking: 金币+4, 鼓励发帖帮助解答问题。 2012-07-17 21:03:16
Taq酶最后会给扩增产物加个A,之后正好可以用于T-A载体的连接。
PFU酶扩增的是你纯粹的产物,你可以再引物设计的时候给带上个AT之类的(建议再去查一下,我也是知道理论,具体做起来还是要搞得清楚些,少走弯路)。
但是跑胶没有跑出来的话,只能说明没有扩增出来,这个可能性就大了。
比如,你确定你的模版里,这个基因是表达的?你的酶没有失活?需要加镁离子吗(没用过,不确定)?
2楼2012-07-17 19:19:49
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ximenzoe

新虫 (初入文坛)

pfu是高保证的,没有A尾
3楼2012-07-18 08:48:33
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123n

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-07-18 13:57:27
楼主:你扩增的片段多长啊?是不是跑胶时间太久导致引物二聚体都木有?按理说应该至少有引物二聚体的! 建议:dNTP量增加,引物量稍微增加点,别忘了pfu酶可是要热启动的哦~~  预祝LZ试验顺利!!!
4楼2012-07-18 10:14:24
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