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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于PFU酶扩增
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sjjsy7

银虫 (小有名气)

[求助] 关于PFU酶扩增

最近用PFU酶想克隆几个水稻基因，可是死活扩不出，先说一下我的体系吧
     25ul体系      dd水14.75ul     10X PFU Buffer2.5ul     dNTP1ul   引物0.5ul      PFU酶0.3ul   temp 1ul
         退火温度55度，延伸2分钟
     最后跑胶的时候连引物二聚体也没有，是不是引物不行啊，还有就是我下一步是接T载体，有人跟我说用PFU扩最后还得另外加A尾巴，Taq酶不用，到底是个什么情况？
        还请哪位虫虫指点迷津！！！！！！！！
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1楼 2012-07-17 18:55:43
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genegop

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-07-18 13:57:48
PFU的延伸速率比Taq慢，需要的时间是扩增片段长度（kb单位）×2（min）。如果你的扩增片段长度超过1kb的话，延伸2 min就不够，需要增加延伸时间。
另外，PFU有3'-5'外切酶活性，准备PCR体系时一定要最后加PFU，不然酶会切割引物。
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6楼2012-07-18 12:10:19
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shenye.judy

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+4, 鼓励发帖帮助解答问题。 2012-07-17 21:03:16
Taq酶最后会给扩增产物加个A，之后正好可以用于T-A载体的连接。
PFU酶扩增的是你纯粹的产物，你可以再引物设计的时候给带上个AT之类的（建议再去查一下，我也是知道理论，具体做起来还是要搞得清楚些，少走弯路）。
但是跑胶没有跑出来的话，只能说明没有扩增出来，这个可能性就大了。
比如，你确定你的模版里，这个基因是表达的？你的酶没有失活？需要加镁离子吗（没用过，不确定）？
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2楼2012-07-17 19:19:49
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ximenzoe

新虫 (初入文坛)
pfu是高保证的，没有A尾
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3楼2012-07-18 08:48:33
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123n

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-07-18 13:57:27
楼主：你扩增的片段多长啊？是不是跑胶时间太久导致引物二聚体都木有？按理说应该至少有引物二聚体的！ 建议：dNTP量增加，引物量稍微增加点，别忘了pfu酶可是要热启动的哦~~  预祝LZ试验顺利！！！
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4楼2012-07-18 10:14:24
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