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sjjsy7

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[求助] 关于PFU酶扩增

最近用PFU酶想克隆几个水稻基因，可是死活扩不出，先说一下我的体系吧
   25ul体系    dd水14.75ul    10X PFU Buffer2.5ul    dNTP1ul 引物0.5ul    PFU酶0.3ul temp 1ul
      退火温度55度，延伸2分钟
   最后跑胶的时候连引物二聚体也没有，是不是引物不行啊，还有就是我下一步是接T载体，有人跟我说用PFU扩最后还得另外加A尾巴，Taq酶不用，到底是个什么情况？

还请哪位虫虫指点迷津！！！！！！！！

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1楼 2012-07-17 18:55:43

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sjjsy7

银虫 (小有名气)

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引用回帖:

6楼: Originally posted by genegop at 2012-07-18 12:10:19
PFU的延伸速率比Taq慢，需要的时间是扩增片段长度（kb单位）×2（min）。如果你的扩增片段长度超过1kb的话，延伸2 min就不够，需要增加延伸时间。
另外，PFU有3'-5'外切酶活性，准备PCR体系时一定要最后加PFU，不然 ...

谢了！！知道了！！

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9楼2012-07-18 12:45:10

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shenye.judy

木虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
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amisking: 金币+4, 鼓励发帖帮助解答问题。 2012-07-17 21:03:16

Taq酶最后会给扩增产物加个A，之后正好可以用于T-A载体的连接。
PFU酶扩增的是你纯粹的产物，你可以再引物设计的时候给带上个AT之类的（建议再去查一下，我也是知道理论，具体做起来还是要搞得清楚些，少走弯路）。
但是跑胶没有跑出来的话，只能说明没有扩增出来，这个可能性就大了。
比如，你确定你的模版里，这个基因是表达的？你的酶没有失活？需要加镁离子吗（没用过，不确定）？