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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 细菌PCR总是点的有些样不出条带
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liaona

铜虫 (小有名气)

[求助] 细菌PCR总是点的有些样不出条带 已有6人参与

提取土壤总DNA，利用细菌V6-V8区引物968F/1401R进行PCR扩增，点的样总是有那么几个不出条带，不清楚什么情况，有师姐说是我做PCR加样操作出问题，可是每次做8个，加样操作都是一样的啊，怎么就有些样p出来，有些没有出来呢。PCR25ul体系：上下游引物各1.5ul，2.5mM each dNTPs 2ul，10xPCR Buffer 2.5 ul，Taq聚合酶0.25ul，模板DNA 2 ul，无菌水 15.25 ul。PCR扩增条件：94 oC变性5min,接着20个循环（94 oC变性1 min，67 oC退火1 min，72 oC延伸1 min，每个循环退火温度降0.5 oC），接着 15个循环（94 oC变性1 min，57oC退火1 min，72 oC延伸1 min，每个循环退火温度降0.5 oC），最后再72 oC延伸10 min。

细菌PCR总是点的有些样不出条带
10.30.2.jpg
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1楼 2015-03-16 17:37:35
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沉默的独角兽

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
稀释一下DNA或者再纯化一下DNA，试试。
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4楼2015-03-16 19:32:39
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kuaile5420

专家顾问 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
模板是一样的土壤细菌吗？还有就是如果是 的话，在加模板之前是否混合均匀了？
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坚持到底就是胜利！
2楼2015-03-16 18:02:47
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liaona

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by kuaile5420 at 2015-03-16 18:02:47
模板是一样的土壤细菌吗？还有就是如果是 的话，在加模板之前是否混合均匀了？

不是的哦！每个点样孔对应我试验处理，共8个土壤处理样品分别提取的DNA。
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3楼2015-03-16 18:24:44
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kuaile5420

专家顾问 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by liaona at 2015-03-16 18:24:44
不是的哦！每个点样孔对应我试验处理，共8个土壤处理样品分别提取的DNA。...

那你使用的引物是针对某种细菌的还是所有的都有啊？如果是特异的话，会不会这种土壤中不含有这种菌？如果不是特异的，就自己再重新做一次PCR试试？还有就是你自己要确定你都提取到了DNA，这个问题可以通过测定每种土壤菌的DNA浓度，并且可以通过计算使得每种土壤菌的模板中含有相同的DNA，这样更能说明模板的问题还是其他操作的问题。因为如果DNA浓度差异很大的话，使用同一台PCR仪同时进行PCR最终的DNA差异会越来越大的，跑胶显示是需要一定量的DNA 才可以的啊。祝你成功啊~
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坚持到底就是胜利！
5楼2015-03-16 21:46:21
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