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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 巢式PCR二轮产物，点样孔似有两点跑不出？？？急急急！！！
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北欧神鱼

金虫 (小有名气)

[求助] 巢式PCR二轮产物，点样孔似有两点跑不出？？？急急急！！！ 已有1人参与

求助内容如题，之前看到有相同的问题，我的情况是这样的：
阳性对照用的全基因组能稳定的P出目标条带来，但是样品提取DNA后，就会出现这种情况。样品中的阳性样品最开始能够很正常的跑出来，但是放置1周左右，就只能出现点样孔有亮点，不出条带，引物二聚体可出现。4°和-20°保存都是这种情况，DNA也反复提取多次，现在直接就不能出现目标条带了！！！
急求解决办法，之前看到有师兄师姐说是可以加SDS，我想知道加多少量在哪一步加合适？
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1楼 2015-03-15 22:08:51
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
不出条带，点样孔有亮点，那是否条带出现整体拖尾呢？
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
2楼2015-03-16 10:25:44
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北欧神鱼

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 18761615793 at 2015-03-16 10:25:44
不出条带，点样孔有亮点，那是否条带出现整体拖尾呢？

之前正常出目标条带的时候有出现过拖尾，但是我第二轮稀释模板以后就没有了。。。现在是没有条带出现，引物二聚体很清楚，不拖尾。
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3楼2015-03-16 10:51:09
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

★ ★
北欧神鱼: 金币+2, ★有帮助 2015-03-16 12:30:02
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3楼: Originally posted by 北欧神鱼 at 2015-03-16 10:51:09
之前正常出目标条带的时候有出现过拖尾，但是我第二轮稀释模板以后就没有了。。。现在是没有条带出现，引物二聚体很清楚，不拖尾。...

没有条带，引物二聚体清楚，量拖尾都没有啊，根据你的描述，模板降解啦，初步这样认为的，可以重提跑试试看嘛
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
4楼2015-03-16 11:06:39
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北欧神鱼

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 18761615793 at 2015-03-16 11:06:39
没有条带，引物二聚体清楚，量拖尾都没有啊，根据你的描述，模板降解啦，初步这样认为的，可以重提跑试试看嘛...

我也怀疑如此，之前看到有人提到SDS，我就有点侥幸，万一没降解呢。。。
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5楼2015-03-16 12:29:51
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北欧神鱼

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 北欧神鱼 at 2015-03-16 12:29:51
我也怀疑如此，之前看到有人提到SDS，我就有点侥幸，万一没降解呢。。。...

我昨天新提的DNA,还是点样孔很亮，有浅浅的拖尾。。。。
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6楼2015-03-16 12:37:29
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 北欧神鱼 at 2015-03-16 12:29:51
我也怀疑如此，之前看到有人提到SDS，我就有点侥幸，万一没降解呢。。。...

也有可能没有降解啊，如果模板没有降解但是又没有扩增出来，那可以考虑所用试剂的问题，是否是酶的扩增效率太差了没有进行镁离子浓度的尝试，加入的DMSO的量啊等等（个人建议尝试热启动Taq酶效果很好http://www.detaibio.com/relia-hotstart-polymerase.html），分子实验因素多样都应该纳入考虑范围，祝 实验顺利哦
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7楼2015-03-16 13:19:26
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