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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求助关于甲基化PCR实验
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raymondleung

铜虫 (小有名气)

[求助] 求助关于甲基化PCR实验 已有2人参与

最近一直在做甲基化的PCR，一直没法获得扩增的条带，模板用的是qiagen的试剂盒处理后的DNA ，PCR是25ul的体系， 用的宝生物的GC buffer和LA taq酶。反应条件95度5min，然后开始循环，95度30s，退火30s , 72度30s，最后延伸10min，4度保温，退火从50到65度都试用了，没见条带。到底是怎么回事？求大神解答
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1楼 2015-01-31 20:13:26
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huanglinmi

铁虫 (初入文坛)
★
raymondleung(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-02-09 22:11:44
1、引物：可以查一下引物设计是否出现了问题？比如说你引物设计的时候是非甲基化，但是经过甲基化处理的模板当然扩不出来？
2、Mg2+离子浓度：是否可以试一下Mg2+的浓度？从1.5、2.5、3.5、4.5mM摸一下？

个人意见，欢迎各位虫友大神指正
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Hi everyone!
2楼2015-02-09 11:12:26
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键盘上的脚丫

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
raymondleung(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-02-09 22:11:56
你做的是预扩增吧？有可能是引物没有设计好，此外，你的酶切和连接可能也不是很好，没办法p出特异性片段。
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3楼2015-02-09 11:53:13
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

★ ★
raymondleung(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-02-09 22:12:06
循环数正常，但是针对LA的酶时间就不一定了，72℃延伸 30s 我觉得时间少了，我们做的话都是10min，终延伸min的。既然摸索了很多温度都没有成功，说明温度没有问题。
LA和热启动Taq酶或是高保真酶不一样，针对大于10kb以上的片段，使用LA扩增， 延伸时间短的话还没来得及扩增就进入下一循环了
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
4楼2015-02-09 14:04:11
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raymondleung

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by huanglinmi at 2015-02-09 11:12:26
1、引物：可以查一下引物设计是否出现了问题？比如说你引物设计的时候是非甲基化，但是经过甲基化处理的模板当然扩不出来？
2、Mg2+离子浓度：是否可以试一下Mg2+的浓度？从1.5、2.5、3.5、4.5mM摸一下？

个人意 ...

谢谢您的解答
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5楼2015-03-12 20:58:04
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raymondleung

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 键盘上的脚丫 at 2015-02-09 11:53:13
你做的是预扩增吧？有可能是引物没有设计好，此外，你的酶切和连接可能也不是很好，没办法p出特异性片段。

谢谢您的答复，我的模板用的是基因组的，不过现在能P出来了
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6楼2015-03-12 21:00:17
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raymondleung

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 18761615793 at 2015-02-09 14:04:11
循环数正常，但是针对LA的酶时间就不一定了，72℃延伸 30s 我觉得时间少了，我们做的话都是10min，终延伸min的。既然摸索了很多温度都没有成功，说明温度没有问题。
LA和热启动Taq酶或是高保真酶不一样，针对大于1 ...

感谢您的答复
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7楼2015-03-12 21:01:29
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键盘上的脚丫

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by raymondleung at 2015-03-12 21:00:17
谢谢您的答复，我的模板用的是基因组的，不过现在能P出来了...

是因为什么原因呢？   对了，你后期要做甲基化位点的克隆吗？ 我想你能否留个q，可以交流
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8楼2015-03-13 11:00:55
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raymondleung

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 键盘上的脚丫 at 2015-03-13 11:00:55
是因为什么原因呢？   对了，你后期要做甲基化位点的克隆吗？ 我想你能否留个q，可以交流...

本来要做的，但我现在毕业了。不好意思，论坛不怎么上，谢谢关注。
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9楼2015-08-11 15:17:08
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