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raymondleung

铜虫 (小有名气)

[求助] 求助关于甲基化PCR实验 已有2人参与

最近一直在做甲基化的PCR,一直没法获得扩增的条带,模板用的是qiagen的试剂盒处理后的DNA ,PCR是25ul的体系, 用的宝生物的GC buffer和LA taq酶。反应条件95度5min,然后开始循环,95度30s,退火30s , 72度30s,最后延伸10min,4度保温,退火从50到65度都试用了,没见条带。到底是怎么回事?求大神解答
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huanglinmi

铁虫 (初入文坛)


raymondleung(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-02-09 22:11:44
1、引物:可以查一下引物设计是否出现了问题?比如说你引物设计的时候是非甲基化,但是经过甲基化处理的模板当然扩不出来?
2、Mg2+离子浓度:是否可以试一下Mg2+的浓度?从1.5、2.5、3.5、4.5mM摸一下?

个人意见,欢迎各位虫友大神指正
Hi everyone!
2楼2015-02-09 11:12:26
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键盘上的脚丫

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


raymondleung(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-02-09 22:11:56
你做的是预扩增吧?有可能是引物没有设计好,此外,你的酶切和连接可能也不是很好,没办法p出特异性片段。
3楼2015-02-09 11:53:13
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

★ ★
raymondleung(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-02-09 22:12:06
循环数正常,但是针对LA的酶时间就不一定了,72℃延伸 30s 我觉得时间少了,我们做的话都是10min,终延伸min的。既然摸索了很多温度都没有成功,说明温度没有问题。
LA和热启动Taq酶或是高保真酶不一样,针对大于10kb以上的片段,使用LA扩增, 延伸时间短的话还没来得及扩增就进入下一循环了
todayisdifficult,tomorrowismoredifficult,butthedayaftertomorrowisbeautiful
4楼2015-02-09 14:04:11
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raymondleung

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by huanglinmi at 2015-02-09 11:12:26
1、引物:可以查一下引物设计是否出现了问题?比如说你引物设计的时候是非甲基化,但是经过甲基化处理的模板当然扩不出来?
2、Mg2+离子浓度:是否可以试一下Mg2+的浓度?从1.5、2.5、3.5、4.5mM摸一下?

个人意 ...

谢谢您的解答
5楼2015-03-12 20:58:04
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raymondleung

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 键盘上的脚丫 at 2015-02-09 11:53:13
你做的是预扩增吧?有可能是引物没有设计好,此外,你的酶切和连接可能也不是很好,没办法p出特异性片段。

谢谢您的答复,我的模板用的是基因组的,不过现在能P出来了
6楼2015-03-12 21:00:17
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raymondleung

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 18761615793 at 2015-02-09 14:04:11
循环数正常,但是针对LA的酶时间就不一定了,72℃延伸 30s 我觉得时间少了,我们做的话都是10min,终延伸min的。既然摸索了很多温度都没有成功,说明温度没有问题。
LA和热启动Taq酶或是高保真酶不一样,针对大于1 ...

感谢您的答复
7楼2015-03-12 21:01:29
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键盘上的脚丫

金虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by raymondleung at 2015-03-12 21:00:17
谢谢您的答复,我的模板用的是基因组的,不过现在能P出来了...

是因为什么原因呢?   对了,你后期要做甲基化位点的克隆吗? 我想你能否留个q,可以交流
8楼2015-03-13 11:00:55
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raymondleung

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 键盘上的脚丫 at 2015-03-13 11:00:55
是因为什么原因呢?   对了,你后期要做甲基化位点的克隆吗? 我想你能否留个q,可以交流...

本来要做的,但我现在毕业了。不好意思,论坛不怎么上,谢谢关注。
9楼2015-08-11 15:17:08
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