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zzlei

金虫 (小有名气)

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[求助] 蛋白过镍柱，出现大量沉淀，请教各位已有1人参与

破碎离心完之后推滤了一下，然后过镍柱，分别用20mL 20mM咪唑（25mM Tris，100mM NaCl)、80mM咪唑、150mM咪唑、350mM咪唑、500mM咪唑洗脱，发现自150mM就能洗出目的蛋白，但杂蛋白也很多。350mM洗脱时蛋白发生沉淀，且15mL的量基本能把柱子里的蛋白全洗脱下来，500时基本就什么都没有了。
试着将350的沉淀用硫酸铵溶解，但效果不好，透析用25mM Tris，300mM NaCl，仍然沉淀挥之不去。透析一直在4℃下搅拌进行。请教各位高手们，是咪唑浓度太高导致了沉淀？沉淀的蛋白是因为变性而无法再溶解？透析液我分别调了100mM NaCl、200mM、300mM，还适当加了5%、10%甘油试着溶解沉淀，但都没有效果。希望大家帮我分析一下到底是什么原因引起的。纯化N多次了，每次都是350的咪唑就沉淀了

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1楼2015-01-27 10:37:40

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zzlei

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那个蛋白透析时将盐浓度调到20mM、100mM、200mM、300mM试了，都不行，难道是因为之前已经沉淀变性了无法再溶解了？
最近又换做了另一个蛋白，这个蛋白师兄们做都没有问题，很纯，表达量也很高，但我一做又出现类似上述的问题。他们说350咪唑时有一部分蛋白，但从未出现过沉淀，500时能收到很纯的。但我的基本都在350洗下来了，而且基本全部沉淀了。500里面也有，也浑浊着。。。
同样试着换了盐浓度，还是没效果。
是不是我操作过程哪儿出问题了？导致在过程中蛋白就变性了？记得以前溶菌超声离心完后得到的蛋白清液基本都是透明的，但现在每次得到的都看着很浑浊。之前我还以为是蛋白表达量很高的原因。
是不是我超声过程出问题了？溶菌用的20mM hepes，得到80mL,分两次超声，每次20~30min