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李袁硕

铜虫 (初入文坛)

[交流] 长片段DNA扩增后电泳挂孔问题 已有3人参与

本人在做长片段的PCR,片段长度大约18kb左右。用1%琼脂糖120V20mins电泳,发现DNA全部停留在胶孔中,比较亮。之后加入等体积的水,电泳,仍有挂孔现象,但目的片段附近有一浅带。将产物放于94度1min,16度正无穷。电泳发现挂孔现象消失(一点都没有了),但是没有主带了,附近弥散装。能否解释?
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稻稻

铜虫 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
对于挂孔现象建议胶浓度低一些,上样量减少,跑久一些。后面的估计降解了,不清楚

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
做一个不动声色的人,不准情绪化,不准回头看。
9楼2015-01-23 23:44:59
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titus0805

铁虫 (小有名气)

★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2015-01-22 16:43:52
18k的片段跑20分钟有点短了,多跑一下,放低电压慢慢跑。出现楼主所说的情况没有见过,普通琼脂糖跑18k没有问题。可以检查一下反应体系,模板里杂质不要太多,最后产物体系太复杂,有可能造成挂孔。
将产物放于94度1min,这是什么意思呢?这样是会弥散的啊,这么长的片段不好完全复性,所以会变成乱七八糟一团麻,弥散太正常了。
2楼2015-01-22 09:19:18
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zliean

金虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
胶浓度太大 0.5就行了

[ 发自小木虫客户端 ]
3楼2015-01-22 09:41:00
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李袁硕

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by titus0805 at 2015-01-22 09:19:18
18k的片段跑20分钟有点短了,多跑一下,放低电压慢慢跑。出现楼主所说的情况没有见过,普通琼脂糖跑18k没有问题。可以检查一下反应体系,模板里杂质不要太多,最后产物体系太复杂,有可能造成挂孔。
将产物放于94度 ...

我的想法是片段太长且浓度太高的时候,DNA会成网状,所以就容易挂孔。所以我就变性之后再复性,看能否有主带
4楼2015-01-22 13:24:20
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