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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 长片段DNA扩增后电泳挂孔问题
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李袁硕

铜虫 (初入文坛)

[交流] 长片段DNA扩增后电泳挂孔问题 已有3人参与

本人在做长片段的PCR，片段长度大约18kb左右。用1%琼脂糖120V20mins电泳，发现DNA全部停留在胶孔中，比较亮。之后加入等体积的水，电泳，仍有挂孔现象，但目的片段附近有一浅带。将产物放于94度1min，16度正无穷。电泳发现挂孔现象消失（一点都没有了），但是没有主带了，附近弥散装。能否解释？
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1楼 2015-01-21 22:55:29
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titus0805

铁虫 (小有名气)
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2015-01-22 16:43:52
18k的片段跑20分钟有点短了，多跑一下，放低电压慢慢跑。出现楼主所说的情况没有见过，普通琼脂糖跑18k没有问题。可以检查一下反应体系，模板里杂质不要太多，最后产物体系太复杂，有可能造成挂孔。
将产物放于94度1min，这是什么意思呢？这样是会弥散的啊，这么长的片段不好完全复性，所以会变成乱七八糟一团麻，弥散太正常了。
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2楼2015-01-22 09:19:18
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zliean

金虫 (小有名气)
★
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胶浓度太大 0.5就行了

[ 发自小木虫客户端 ]
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3楼2015-01-22 09:41:00
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李袁硕

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by titus0805 at 2015-01-22 09:19:18
18k的片段跑20分钟有点短了，多跑一下，放低电压慢慢跑。出现楼主所说的情况没有见过，普通琼脂糖跑18k没有问题。可以检查一下反应体系，模板里杂质不要太多，最后产物体系太复杂，有可能造成挂孔。
将产物放于94度 ...

我的想法是片段太长且浓度太高的时候，DNA会成网状，所以就容易挂孔。所以我就变性之后再复性，看能否有主带
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4楼2015-01-22 13:24:20
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titus0805

铁虫 (小有名气)
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4楼: Originally posted by 李袁硕 at 2015-01-22 13:24:20
我的想法是片段太长且浓度太高的时候，DNA会成网状，所以就容易挂孔。所以我就变性之后再复性，看能否有主带...

你太有想象力了，dna不会呈网状！
变性以后复性是要条件的，像这么长的片段，想完全复性太难了，这时候DNA呈一种单双链和各种聚合体混杂的形态
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5楼2015-01-22 13:30:43
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李袁硕

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by titus0805 at 2015-01-22 13:30:43
你太有想象力了，dna不会呈网状！
变性以后复性是要条件的，像这么长的片段，想完全复性太难了，这时候DNA呈一种单双链和各种聚合体混杂的形态...

那它为什么挂孔，稀释以后就不挂孔了呢
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6楼2015-01-22 13:34:05
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titus0805

铁虫 (小有名气)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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6楼: Originally posted by 李袁硕 at 2015-01-22 13:34:05
那它为什么挂孔，稀释以后就不挂孔了呢...

你产物里可能有蛋白污染，稀释以后蛋白少了
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7楼2015-01-22 13:40:59
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李袁硕

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by titus0805 at 2015-01-22 13:40:59
你产物里可能有蛋白污染，稀释以后蛋白少了...

今天我将他在94℃1min，92℃1min，90℃1min，68℃15mins（就是上回稀释过然后再变形成单链的样品）然后又挂孔了。按道理来说蛋白已经稀释了呢
并且这个片段每次扩增都是挂孔
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8楼2015-01-23 22:49:59
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稻稻

铜虫 (著名写手)
★
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对于挂孔现象建议胶浓度低一些，上样量减少，跑久一些。后面的估计降解了，不清楚

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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做一个不动声色的人，不准情绪化，不准回头看。
9楼2015-01-23 23:44:59
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