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李袁硕

铜虫 (初入文坛)

[交流] 长片段DNA扩增后电泳挂孔问题 已有3人参与

本人在做长片段的PCR,片段长度大约18kb左右。用1%琼脂糖120V20mins电泳,发现DNA全部停留在胶孔中,比较亮。之后加入等体积的水,电泳,仍有挂孔现象,但目的片段附近有一浅带。将产物放于94度1min,16度正无穷。电泳发现挂孔现象消失(一点都没有了),但是没有主带了,附近弥散装。能否解释?
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titus0805

铁虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
6楼: Originally posted by 李袁硕 at 2015-01-22 13:34:05
那它为什么挂孔,稀释以后就不挂孔了呢...

你产物里可能有蛋白污染,稀释以后蛋白少了
7楼2015-01-22 13:40:59
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titus0805

铁虫 (小有名气)

★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2015-01-22 16:43:52
18k的片段跑20分钟有点短了,多跑一下,放低电压慢慢跑。出现楼主所说的情况没有见过,普通琼脂糖跑18k没有问题。可以检查一下反应体系,模板里杂质不要太多,最后产物体系太复杂,有可能造成挂孔。
将产物放于94度1min,这是什么意思呢?这样是会弥散的啊,这么长的片段不好完全复性,所以会变成乱七八糟一团麻,弥散太正常了。
2楼2015-01-22 09:19:18
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zliean

金虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
胶浓度太大 0.5就行了

[ 发自小木虫客户端 ]
3楼2015-01-22 09:41:00
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李袁硕

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by titus0805 at 2015-01-22 09:19:18
18k的片段跑20分钟有点短了,多跑一下,放低电压慢慢跑。出现楼主所说的情况没有见过,普通琼脂糖跑18k没有问题。可以检查一下反应体系,模板里杂质不要太多,最后产物体系太复杂,有可能造成挂孔。
将产物放于94度 ...

我的想法是片段太长且浓度太高的时候,DNA会成网状,所以就容易挂孔。所以我就变性之后再复性,看能否有主带
4楼2015-01-22 13:24:20
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