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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 分子生理 » 求助关于his标签的ip
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wenzi6337

木虫 (著名写手)

[求助] 求助关于his标签的ip 已有2人参与

我准备用表达的his融合蛋白钓取细胞裂解液中与之相互作用的蛋白，
设想是先将大肠杆菌中表达的蛋白用his-band纯化，
再用纯化的蛋白和细胞裂解液孵育，
用his的单抗挂孵育获得的复合体蛋白，
再用蛋白A挂his的抗体（含his抗体，his融合蛋白和与之相互作用蛋白），
最后用银染分离蛋白，
打质谱鉴定与我的his融合蛋白相互作用的蛋白。
请问各位虫友我的设计是否可行？
谢谢！
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1楼 2015-01-17 10:19:30
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ptttmt

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2015-01-17 12:02:21
wenzi6337: 金币+10, ★★★很有帮助, 谢谢！ 2015-01-17 13:40:43
搞这么麻烦，搭桥搭这么多，为啥不尝试用Ni-NTA-琼脂糖bead结合大肠杆菌中的his融合蛋白，然后加washing buffer清洗琼脂糖bead，将bead加入到细胞裂解液例，孵育，然后再次washing，washing，washing，然后加入洗脱buffer，加loading buffer制样跑PAGE？

全程在一个EP管中操作，多简单啊。
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2楼2015-01-17 11:22:15
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wenzi6337

木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ptttmt at 2015-01-17 11:22:15
搞这么麻烦，搭桥搭这么多，为啥不尝试用Ni-NTA-琼脂糖bead结合大肠杆菌中的his融合蛋白，然后加washing buffer清洗琼脂糖bead，将bead加入到细胞裂解液例，孵育，然后再次washing，washing，washing，然后加入洗脱 ...

这个Ni-NTA-琼脂糖bead 和镍柱填料的resin是一样的吗？
赞一下 回复此楼
3楼2015-01-17 13:41:49
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ptttmt

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
wenzi6337: 金币+5, ★有帮助, 嗯，我现在有novagen的His Bind Resin，可以先做一下 2015-01-22 14:52:53
引用回帖:
3楼: Originally posted by wenzi6337 at 2015-01-17 13:41:49
这个Ni-NTA-琼脂糖bead 和镍柱填料的resin是一样的吗？...

不同公司的Ni柱填料可能基质会不一样，不过木有关系，做这个试验要做好对照，找个其他无关的his蛋白作对照，用resin螯合，其余跟样品是一样一样的操作
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4楼2015-01-17 14:15:39
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lijing1212

禁虫 (初入文坛)
本帖内容被屏蔽
5楼2015-01-22 11:20:52
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titus0805

铁虫 (小有名气)
你那个蛋白A是什么东西？不就是一个pulldown吗？
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6楼2015-01-22 11:26:44
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wenzi6337

木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by titus0805 at 2015-01-22 11:26:44
你那个蛋白A是什么东西？不就是一个pulldown吗？

之前想的复杂了，确实是pull-down可以解决，谢谢！
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7楼2015-01-22 14:54:51
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人

【答案】应助回帖

质谱做蛋白组学不能用银染
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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
8楼2015-01-23 11:42:35
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teainblack

新虫 (初入文坛)
你用的哪家的HIS抗体？  求推荐。。。
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9楼2015-02-13 10:14:55
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