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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 半定量一个组织PCR做不出来，求助
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supersky3195

银虫 (小有名气)

[求助] 半定量一个组织PCR做不出来，求助已有4人参与

我是做3个组织的半定量，浓度开始很高，在500ng左右，在500ng浓度时（是有些高），A和B组织的内参和目的基因都能跑出来，C组织跑不出来，之后我就稀释，并做了梯度，A和B 也都能跑出来，但是C却跑不出来。我把初始浓度的模板跑了块胶，都有亮带，且C的最亮，将三个组织跑了内参并且跑胶，也是能检测出来，但为什么做半定量时C却一直跑不出来。C组织我一共做了500ng,100ng,50ng,25ng的，都不理想，低浓度下只有零星的几个能跑出来，但CT 较高，请问各位高手大侠，小弟真是有些没办法了，是否需要将原模板用试剂盒纯化下？
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你今天的态度决定你今后的人生。
1楼2015-01-15 01:50:25
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
7楼: Originally posted by supersky3195 at 2015-01-15 19:35:04
高浓度和低浓度的都跑过，就是不出。单独跑mRNA，条带清晰、亮，和其他两个组织的条带是一样的。...

mRNA的丰度不会很高，通常看到是应该是rRNA。通常内参的表达水平是比较高的，也比较容易做出来。可能是你的目标基因的转录水平太低了。
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8楼2015-01-15 23:25:03
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
你定量的是mRNA吗？
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2楼2015-01-15 08:34:47
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晞朔

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2015-01-15 18:12:25
你做的是半定量还是实时荧光定量？模板是cDNA？如果内参都能跑出来，特定基因跑不出来，这很正常啊。
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3楼2015-01-15 10:23:01
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494118250

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2015-01-15 18:12:31
楼上说的对，内参跑出来，目的片段没有的话，说明不表达或表达量极低，检测不到
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4楼2015-01-15 13:37:05
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