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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 半定量pcr一直做不出，很痛苦！
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押沙龙1989

新虫 (小有名气)

[求助] 半定量pcr一直做不出，很痛苦！ 已有6人参与

大家好！我最近在做一植物里面热激转录因子的半定量，一直不稳定，目的基因和内参都是有时扩得出有时扩不出，甚至同一管cDNA也出现这种情况，引物换了，酶也换了，情况还是那样，搞了两三个月一点进展都没有。
        我现在研二，因为是刚接触分子实验老师就让我做半定量，这边也没有师兄师姐可以请教，有时遇到一些问题都很难解决，所以现在心情很是压抑，望各位前辈能给予指导！
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牵牛花呀，一朵深渊色。
1楼 2015-01-12 17:19:01
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晞朔

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2015-01-15 18:37:22
RNA、cDNA的质量如何？内参基因都扩不出来吗？先用内参确定你的模板能用。
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2楼2015-01-12 17:57:13
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押沙龙1989

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 晞朔 at 2015-01-12 17:57:13
RNA、cDNA的质量如何？内参基因都扩不出来吗？先用内参确定你的模板能用。

RNA应该还可以，问了一下别人，也说内参应该扩得出。同一管cDNA内参有时扩得出有时扩不出，总是不稳定。我这边pcr仪挂壁比较严重，P完后25ul有10多ul挂在壁上，这个影响大么？
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牵牛花呀，一朵深渊色。
3楼2015-01-12 21:44:58
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晞朔

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 押沙龙1989 at 2015-01-12 21:44:58
RNA应该还可以，问了一下别人，也说内参应该扩得出。同一管cDNA内参有时扩得出有时扩不出，总是不稳定。我这边pcr仪挂壁比较严重，P完后25ul有10多ul挂在壁上，这个影响大么？...

P之前离心一下，不行，换一台PCR仪试试
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4楼2015-01-12 21:48:42
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押沙龙1989

新虫 (小有名气)
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4楼: Originally posted by 晞朔 at 2015-01-12 21:48:42
P之前离心一下，不行，换一台PCR仪试试...

恩，我们这边条件比较差，老师也是让我提了RNA之后在别的实验室去做，多谢前辈了！
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牵牛花呀，一朵深渊色。
5楼2015-01-12 21:56:10
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晞朔

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 押沙龙1989 at 2015-01-12 21:56:10
恩，我们这边条件比较差，老师也是让我提了RNA之后在别的实验室去做，多谢前辈了！...

不谢
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6楼2015-01-12 21:56:36
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曼舞流苏

新虫 (小有名气)
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3楼: Originally posted by 押沙龙1989 at 2015-01-12 21:44:58
RNA应该还可以，问了一下别人，也说内参应该扩得出。同一管cDNA内参有时扩得出有时扩不出，总是不稳定。我这边pcr仪挂壁比较严重，P完后25ul有10多ul挂在壁上，这个影响大么？...

开什么玩笑，难道你去跑PCR时候不用离心？？？
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7楼2015-01-13 16:40:25
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押沙龙1989

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 曼舞流苏 at 2015-01-13 16:40:25
开什么玩笑，难道你去跑PCR时候不用离心？？？...

我说的是跑完pcr之后挂壁很严重，这个对结果影响大吗？
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牵牛花呀，一朵深渊色。
8楼2015-01-14 09:28:48
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曼舞流苏

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 押沙龙1989 at 2015-01-14 09:28:48
我说的是跑完pcr之后挂壁很严重，这个对结果影响大吗？...

估计是中间升降温度时候挥发所致，如果PCR反应体系量比较多的话影响不大，如果你们用的是适用384孔板的PCR仪，每孔量少的话还是会有影响的。。
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9楼2015-01-14 13:19:42
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押沙龙1989

新虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 曼舞流苏 at 2015-01-14 13:19:42
估计是中间升降温度时候挥发所致，如果PCR反应体系量比较多的话影响不大，如果你们用的是适用384孔板的PCR仪，每孔量少的话还是会有影响的。。...

哦哦，请问你做过半定量没？我是新手，很多地方都不太懂，现在做得都不知道能不能回家过年了，，，希望能够向你多多请教！
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牵牛花呀，一朵深渊色。
10楼2015-01-14 17:04:19
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