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押沙龙1989

新虫 (小有名气)

[求助] 半定量pcr一直做不出,很痛苦! 已有6人参与

大家好!我最近在做一植物里面热激转录因子的半定量,一直不稳定,目的基因和内参都是有时扩得出有时扩不出,甚至同一管cDNA也出现这种情况,引物换了,酶也换了,情况还是那样,搞了两三个月一点进展都没有。
        我现在研二,因为是刚接触分子实验老师就让我做半定量,这边也没有师兄师姐可以请教,有时遇到一些问题都很难解决,所以现在心情很是压抑,望各位前辈能给予指导!
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牵牛花呀,一朵深渊色。
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晞朔

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2015-01-15 18:37:22
RNA、cDNA的质量如何?内参基因都扩不出来吗?先用内参确定你的模板能用。
2楼2015-01-12 17:57:13
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押沙龙1989

新虫 (小有名气)

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2楼: Originally posted by 晞朔 at 2015-01-12 17:57:13
RNA、cDNA的质量如何?内参基因都扩不出来吗?先用内参确定你的模板能用。

RNA应该还可以,问了一下别人,也说内参应该扩得出。同一管cDNA内参有时扩得出有时扩不出,总是不稳定。我这边pcr仪挂壁比较严重,P完后25ul有10多ul挂在壁上,这个影响大么?
牵牛花呀,一朵深渊色。
3楼2015-01-12 21:44:58
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晞朔

金虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 押沙龙1989 at 2015-01-12 21:44:58
RNA应该还可以,问了一下别人,也说内参应该扩得出。同一管cDNA内参有时扩得出有时扩不出,总是不稳定。我这边pcr仪挂壁比较严重,P完后25ul有10多ul挂在壁上,这个影响大么?...

P之前离心一下,不行,换一台PCR仪试试
4楼2015-01-12 21:48:42
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押沙龙1989

新虫 (小有名气)

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4楼: Originally posted by 晞朔 at 2015-01-12 21:48:42
P之前离心一下,不行,换一台PCR仪试试...

恩,我们这边条件比较差,老师也是让我提了RNA之后在别的实验室去做,多谢前辈了!
牵牛花呀,一朵深渊色。
5楼2015-01-12 21:56:10
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晞朔

金虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 押沙龙1989 at 2015-01-12 21:56:10
恩,我们这边条件比较差,老师也是让我提了RNA之后在别的实验室去做,多谢前辈了!...

不谢
6楼2015-01-12 21:56:36
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曼舞流苏

新虫 (小有名气)

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3楼: Originally posted by 押沙龙1989 at 2015-01-12 21:44:58
RNA应该还可以,问了一下别人,也说内参应该扩得出。同一管cDNA内参有时扩得出有时扩不出,总是不稳定。我这边pcr仪挂壁比较严重,P完后25ul有10多ul挂在壁上,这个影响大么?...

开什么玩笑,难道你去跑PCR时候不用离心???
7楼2015-01-13 16:40:25
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押沙龙1989

新虫 (小有名气)

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7楼: Originally posted by 曼舞流苏 at 2015-01-13 16:40:25
开什么玩笑,难道你去跑PCR时候不用离心???...

我说的是跑完pcr之后挂壁很严重,这个对结果影响大吗?
牵牛花呀,一朵深渊色。
8楼2015-01-14 09:28:48
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曼舞流苏

新虫 (小有名气)

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8楼: Originally posted by 押沙龙1989 at 2015-01-14 09:28:48
我说的是跑完pcr之后挂壁很严重,这个对结果影响大吗?...

估计是中间升降温度时候挥发所致,如果PCR反应体系量比较多的话影响不大,如果你们用的是适用384孔板的PCR仪,每孔量少的话还是会有影响的。。
9楼2015-01-14 13:19:42
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押沙龙1989

新虫 (小有名气)

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9楼: Originally posted by 曼舞流苏 at 2015-01-14 13:19:42
估计是中间升降温度时候挥发所致,如果PCR反应体系量比较多的话影响不大,如果你们用的是适用384孔板的PCR仪,每孔量少的话还是会有影响的。。...

哦哦,请问你做过半定量没?我是新手,很多地方都不太懂,现在做得都不知道能不能回家过年了,,,希望能够向你多多请教!
牵牛花呀,一朵深渊色。
10楼2015-01-14 17:04:19
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