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supersky3195

银虫 (小有名气)

[求助] 半定量一个组织PCR做不出来,求助已有4人参与

我是做3个组织的半定量,浓度开始很高,在500ng左右,在500ng浓度时(是有些高),A和B组织的内参和目的基因都能跑出来,C组织跑不出来,之后我就稀释,并做了梯度,A和B 也都能跑出来,但是C却跑不出来。我把初始浓度的模板跑了块胶,都有亮带,且C的最亮,将三个组织跑了内参并且跑胶,也是能检测出来,但为什么做半定量时C却一直跑不出来。C组织我一共做了500ng,100ng,50ng,25ng的,都不理想,低浓度下只有零星的几个能跑出来,但CT 较高,请问各位高手大侠,小弟真是有些没办法了,是否需要将原模板用试剂盒纯化下?
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晞朔

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2015-01-15 18:12:25
你做的是半定量还是实时荧光定量?模板是cDNA?如果内参都能跑出来,特定基因跑不出来,这很正常啊。
3楼2015-01-15 10:23:01
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普通回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

你定量的是mRNA吗?
2楼2015-01-15 08:34:47
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494118250

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2015-01-15 18:12:31
楼上说的对,内参跑出来,目的片段没有的话,说明不表达或表达量极低,检测不到
4楼2015-01-15 13:37:05
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supersky3195

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2015-01-15 08:34:47
你定量的是mRNA吗?

对我做的是mRNA
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5楼2015-01-15 19:33:01
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supersky3195

银虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 晞朔 at 2015-01-15 10:23:01
你做的是半定量还是实时荧光定量?模板是cDNA?如果内参都能跑出来,特定基因跑不出来,这很正常啊。

C组织理论上表达是很高的,检测的时候浓度也是最高的,所以做了稀释。但是这个组织内参和目的基因都跑不出来。其他的两个组织内参和目的基因都能跑出来。
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6楼2015-01-15 19:34:11
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supersky3195

银虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 494118250 at 2015-01-15 13:37:05
楼上说的对,内参跑出来,目的片段没有的话,说明不表达或表达量极低,检测不到

高浓度和低浓度的都跑过,就是不出。单独跑mRNA,条带清晰、亮,和其他两个组织的条带是一样的。
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7楼2015-01-15 19:35:04
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
引用回帖:
7楼: Originally posted by supersky3195 at 2015-01-15 19:35:04
高浓度和低浓度的都跑过,就是不出。单独跑mRNA,条带清晰、亮,和其他两个组织的条带是一样的。...

mRNA的丰度不会很高,通常看到是应该是rRNA。通常内参的表达水平是比较高的,也比较容易做出来。可能是你的目标基因的转录水平太低了。
8楼2015-01-15 23:25:03
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快乐农夫

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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supersky3195: 金币+5 2015-01-16 15:27:09
直接做定量,不要在半定量上无谓的浪费时间,半定量的结果说实话我自己都不信,我调内参都直接测cDNA浓度上定量,根本不跑琼脂糖凝胶

[ 发自小木虫客户端 ]
9楼2015-01-15 23:52:19
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一直打酱油

木虫 (著名写手)

老乡,是你啊

[ 发自小木虫客户端 ]
10楼2015-01-15 23:54:11
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