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moshangchenx金虫 (正式写手)
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目的片段一端是粘性末端,一端是平末端与相应载体的连接如何提高效率?急! 已有12人参与
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我最近在做一个片段与载体的连接构建一个质粒,连了很多次都没连上. 具体如下:我的目的片段一端是粘性末端(Spe I 酶切位点),一端是平末端(SMA I 酶切位点).片段是PCR后连在T载体上测序正确,双酶切效果可以切出两条相应大小的片段.载体是pDBLeu,内含Spe I 与SMA I 酶切位点.其双酶切出的片段与未酶切的片段有电泳大小的区别.目的片段与载体我都双酶切后进行胶回收用去离子水溶解.回收产物电泳可看到模糊条带. 我做了十几次片段与载体不同浓度的连接,Takara Solutiuon I 、TIANGEN的T4DNA连接酶进行16度过夜连接以及用PCR仪进行过夜变温连接,用未酶切的pDBLeu质粒做阳性对照.结果,阳性对照的平板上每次都产生很多菌落,但做连接的板上一个菌落都没有.载体双酶切后片段长9800多bp，目标片段为1800多bp。 做了很多次了都如此,都快做的没信心做下去了,有哪个大哥大姐给我一些建设性意见吗?多谢了!!! |
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【答案】应助回帖
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西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-01-13 22:32:18
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西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-01-13 22:32:18
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目标载体一般酶切后直接过柱纯化即可，不用胶回收，胶回收损失大，且切下来的多半是多克隆位点间的小片段，纯化中大多不会保留下来，对后面连接没什么影响。目的片段也可以直接PCR获得后酶切得到，当然设计引物时得考虑必要的保护碱基才切得下来，也是酶切后直接过柱纯化，不要胶回收。中间可以将目的片段和目的载体酶切纯化后的产物电泳看看质量好不好。酶连可以用烧杯盛常温自来水，将混合的酶连体系放在烧杯中水浴，然后置于4度冰箱自然冷却过夜。这样差不多是水从25度左右缓慢下降至4度，多数酶连标注16度反应，但最佳温度不一定是16度，水缓慢冷却中总有一段最适温度适合你。祝你好运！ [ 发自小木虫客户端 ] |
16楼2015-01-13 10:04:19
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