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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 目的片段一端是粘性末端,一端是平末端与相应载体的连接如何提高效率?急!
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781055707

木虫 (著名写手)
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-01-13 22:30:58
引用回帖:
10楼: Originally posted by moshangchenx at 2015-01-12 16:37:53
谢谢您的应助！新的连接酶昨天也用过，但还是没做出来！我还有个问题想问一下，我的载体长9903bp，目标片段是1863bp，用的胶回收试剂盒是回收70bp-10kb的，但是回收的小片段很清楚但大片段是弥散的，所以采用的酚氯 ...

9000BP的我用试剂盒也收过，没什么问题。可能是你原本载体的感受态（中的DNA酶)对你载体质粒的影响，就会使你酶切后的质粒无法与目的片段链接，你胶回收后的载体浓度时多少，是不是10几NG?载体的感受态是什么？建议将质粒转化进DH5A中，在重提质粒，在连接过。新的连接酶连接其他质粒能连上的吧？
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采菊东篱下，悠然见南山。
11楼2015-01-12 17:28:20
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781055707

木虫 (著名写手)
（目的片段与载体我都双酶切后进行胶回收用去离子水溶解.回收产物电泳可看到模糊条带.）胶回收时可以看到清晰的两条带，回收以后我一般不跑电泳的。
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采菊东篱下，悠然见南山。
12楼2015-01-12 17:35:02
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781055707

木虫 (著名写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 781055707 at 2015-01-12 17:35:02
（目的片段与载体我都双酶切后进行胶回收用去离子水溶解.回收产物电泳可看到模糊条带.）胶回收时可以看到清晰的两条带，回收以后我一般不跑电泳的。

我一直连接成功的都能看到清晰的条带，条带淡点可以的，一团的话就要改变改变条件了。
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采菊东篱下，悠然见南山。
13楼2015-01-12 17:37:54
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bonbonzd

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 2015-01-13 22:31:12
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-01-13 22:31:28
1.可否尝试多做几个目的片段与载体比例不同的连接，感觉连接比例对于连接成功与否很关键
2.楼主的宿主菌是大肠杆菌还是其他，还有采用的是电转还是氯化钙法，阳性板上不长菌，不一定是连接不成功，也可能是转化不成功
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14楼2015-01-13 09:25:50
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mmrf2008

至尊木虫 (著名写手)

开心的朋友

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-13 22:31:50
建议不要进行胶回收，损失量太大，特别是目的基因。可利用宝生物或omega的pcr产物和酶切产物直接回收的盒子，当然要跑胶鉴定酶切效果。这样量可以确保。

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笑看人生，花开花落
15楼2015-01-13 09:46:55
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Love_8023

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-01-13 22:32:18
目标载体一般酶切后直接过柱纯化即可，不用胶回收，胶回收损失大，且切下来的多半是多克隆位点间的小片段，纯化中大多不会保留下来，对后面连接没什么影响。目的片段也可以直接PCR获得后酶切得到，当然设计引物时得考虑必要的保护碱基才切得下来，也是酶切后直接过柱纯化，不要胶回收。中间可以将目的片段和目的载体酶切纯化后的产物电泳看看质量好不好。酶连可以用烧杯盛常温自来水，将混合的酶连体系放在烧杯中水浴，然后置于4度冰箱自然冷却过夜。这样差不多是水从25度左右缓慢下降至4度，多数酶连标注16度反应，但最佳温度不一定是16度，水缓慢冷却中总有一段最适温度适合你。祝你好运！

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16楼2015-01-13 10:04:19
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yangzhx

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-13 22:32:43
可能是跑胶染料的问题，不知你用的什么染料。染料能和DNA结合，影响连接效率。建议更换染料或者减少加入的量。
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17楼2015-01-13 16:49:34
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moshangchenx

金虫 (正式写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by bonbonzd at 2015-01-13 09:25:50
1.可否尝试多做几个目的片段与载体比例不同的连接，感觉连接比例对于连接成功与否很关键
2.楼主的宿主菌是大肠杆菌还是其他，还有采用的是电转还是氯化钙法，阳性板上不长菌，不一定是连接不成功，也可能是转化不成 ...

现在正在是不同的比例，我的宿主菌是JM109，采用的氯化钙法，每次未酶切载体做对照都能长出来
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科研无止境，我心成蹉跎
18楼2015-01-14 19:20:38
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moshangchenx

金虫 (正式写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by mmrf2008 at 2015-01-13 09:46:55
建议不要进行胶回收，损失量太大，特别是目的基因。可利用宝生物或omega的pcr产物和酶切产物直接回收的盒子，当然要跑胶鉴定酶切效果。这样量可以确保。

谢谢，可以试一试
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科研无止境，我心成蹉跎
19楼2015-01-14 19:20:59
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moshangchenx

金虫 (正式写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by Love_8023 at 2015-01-13 10:04:19
目标载体一般酶切后直接过柱纯化即可，不用胶回收，胶回收损失大，且切下来的多半是多克隆位点间的小片段，纯化中大多不会保留下来，对后面连接没什么影响。目的片段也可以直接PCR获得后酶切得到，当然设计引物时得 ...

您好，请问直接过柱是用的什么柱子，有专门的试剂盒还是用胶回收试剂盒或者是提取基因组DNA的试剂盒里的柱子？
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科研无止境，我心成蹉跎
20楼2015-01-14 19:22:46
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