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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 目的片段一端是粘性末端,一端是平末端与相应载体的连接如何提高效率?急!
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moshangchenx

金虫 (正式写手)

[求助] 目的片段一端是粘性末端,一端是平末端与相应载体的连接如何提高效率?急! 已有12人参与

我最近在做一个片段与载体的连接构建一个质粒,连了很多次都没连上.
具体如下:我的目的片段一端是粘性末端(Spe I 酶切位点),一端是平末端(SMA I 酶切位点).片段是PCR后连在T载体上测序正确,双酶切效果可以切出两条相应大小的片段.载体是pDBLeu,内含Spe I 与SMA I 酶切位点.其双酶切出的片段与未酶切的片段有电泳大小的区别.目的片段与载体我都双酶切后进行胶回收用去离子水溶解.回收产物电泳可看到模糊条带.
我做了十几次片段与载体不同浓度的连接,Takara Solutiuon I 、TIANGEN的T4DNA连接酶进行16度过夜连接以及用PCR仪进行过夜变温连接,用未酶切的pDBLeu质粒做阳性对照.结果,阳性对照的平板上每次都产生很多菌落,但做连接的板上一个菌落都没有.载体双酶切后片段长9800多bp，目标片段为1800多bp。
做了很多次了都如此,都快做的没信心做下去了,有哪个大哥大姐给我一些建设性意见吗?多谢了!!!
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1楼 2015-01-12 09:05:12
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mmrf2008

至尊木虫 (著名写手)

开心的朋友

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-13 22:31:50
建议不要进行胶回收，损失量太大，特别是目的基因。可利用宝生物或omega的pcr产物和酶切产物直接回收的盒子，当然要跑胶鉴定酶切效果。这样量可以确保。

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笑看人生，花开花落
15楼2015-01-13 09:46:55
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查看全部 33 个回答

moshangchenx

金虫 (正式写手)
胶回收的时候先用AXYGEN的回收试剂盒，但效果不大好，之后采用冷冻离心经酚-氯仿抽提进行胶回收的
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科研无止境，我心成蹉跎
2楼2015-01-12 09:08:50
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moshangchenx

金虫 (正式写手)
也进行过4度过夜连接，但也没长，做了快两个月了，真心快崩溃了..........
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科研无止境，我心成蹉跎
3楼2015-01-12 09:18:38
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晞朔

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
既然这么难做，为什么不试试换酶切位点呢？
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4楼2015-01-12 10:00:14
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