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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 目的片段一端是粘性末端,一端是平末端与相应载体的连接如何提高效率?急!
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moshangchenx

金虫 (正式写手)

[求助] 目的片段一端是粘性末端,一端是平末端与相应载体的连接如何提高效率?急!已有12人参与

我最近在做一个片段与载体的连接构建一个质粒,连了很多次都没连上.
具体如下:我的目的片段一端是粘性末端(Spe I 酶切位点),一端是平末端(SMA I 酶切位点).片段是PCR后连在T载体上测序正确,双酶切效果可以切出两条相应大小的片段.载体是pDBLeu,内含Spe I 与SMA I 酶切位点.其双酶切出的片段与未酶切的片段有电泳大小的区别.目的片段与载体我都双酶切后进行胶回收用去离子水溶解.回收产物电泳可看到模糊条带.
我做了十几次片段与载体不同浓度的连接,Takara Solutiuon I 、TIANGEN的T4DNA连接酶进行16度过夜连接以及用PCR仪进行过夜变温连接,用未酶切的pDBLeu质粒做阳性对照.结果,阳性对照的平板上每次都产生很多菌落,但做连接的板上一个菌落都没有.载体双酶切后片段长9800多bp，目标片段为1800多bp。
做了很多次了都如此,都快做的没信心做下去了,有哪个大哥大姐给我一些建设性意见吗?多谢了!!!
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科研无止境，我心成蹉跎
1楼2015-01-12 09:05:12
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

Love_8023

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-01-13 22:32:18
目标载体一般酶切后直接过柱纯化即可，不用胶回收，胶回收损失大，且切下来的多半是多克隆位点间的小片段，纯化中大多不会保留下来，对后面连接没什么影响。目的片段也可以直接PCR获得后酶切得到，当然设计引物时得考虑必要的保护碱基才切得下来，也是酶切后直接过柱纯化，不要胶回收。中间可以将目的片段和目的载体酶切纯化后的产物电泳看看质量好不好。酶连可以用烧杯盛常温自来水，将混合的酶连体系放在烧杯中水浴，然后置于4度冰箱自然冷却过夜。这样差不多是水从25度左右缓慢下降至4度，多数酶连标注16度反应，但最佳温度不一定是16度，水缓慢冷却中总有一段最适温度适合你。祝你好运！

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16楼2015-01-13 10:04:19
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moshangchenx

金虫 (正式写手)
胶回收的时候先用AXYGEN的回收试剂盒，但效果不大好，之后采用冷冻离心经酚-氯仿抽提进行胶回收的
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科研无止境，我心成蹉跎
2楼2015-01-12 09:08:50
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moshangchenx

金虫 (正式写手)
也进行过4度过夜连接，但也没长，做了快两个月了，真心快崩溃了..........
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科研无止境，我心成蹉跎
3楼2015-01-12 09:18:38
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晞朔

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
既然这么难做，为什么不试试换酶切位点呢？
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4楼2015-01-12 10:00:14
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moshangchenx

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 晞朔 at 2015-01-12 10:00:14
既然这么难做，为什么不试试换酶切位点呢？

我也想换，但老师不同意，很纠结
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科研无止境，我心成蹉跎
5楼2015-01-12 10:05:28
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晞朔

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by moshangchenx at 2015-01-12 10:05:28
我也想换，但老师不同意，很纠结...

如果你自己能换了，并且做出来结果，有什么不同意的呢？
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6楼2015-01-12 10:08:27
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moshangchenx

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 晞朔 at 2015-01-12 10:08:27
如果你自己能换了，并且做出来结果，有什么不同意的呢？...

我们老师很固执，他认为能做出来，是我能力不行，这两个位点是他设计的，可能是嫌我说他位点弄得不好吧，现在一说换位点，他就很生气，唉
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科研无止境，我心成蹉跎
7楼2015-01-12 10:13:07
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molizerd

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by moshangchenx at 2015-01-12 09:08:50
胶回收的时候先用AXYGEN的回收试剂盒，但效果不大好，之后采用冷冻离心经酚-氯仿抽提进行胶回收的

他家胶回收试剂盒不好用。我们用那个小绿盒子的。。omega的那个。。
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8楼2015-01-12 15:41:26
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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moshangchenx: 金币+2, ★有帮助 2015-01-12 16:33:34
（回收产物电泳可看到模糊条带）好的胶回收产物很清晰的。你的目的片段与载体也都没问题，都切动了，转化阳性的也有了，唯一的变量就是t4NDA连接酶，换新的吧，设计两个连接体系标准连接1;载体200NG    ,目的片段184NG,T4连接酶1u了，加水到20.        2载体100NG,,,目的片段92NG,T4连接酶1u了，加水到20.         16度连接16小时，取10UL转化200UL感受态。祝你成功。
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采菊东篱下，悠然见南山。
9楼2015-01-12 16:07:01
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moshangchenx

金虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 781055707 at 2015-01-12 16:07:01
（回收产物电泳可看到模糊条带）好的胶回收产物很清晰的。你的目的片段与载体也都没问题，都切动了，转化阳性的也有了，唯一的变量就是t4NDA连接酶，换新的吧，设计两个连接体系标准连接1;载体200NG    ,目的片段18 ...

谢谢您的应助！新的连接酶昨天也用过，但还是没做出来！我还有个问题想问一下，我的载体长9903bp，目标片段是1863bp，用的胶回收试剂盒是回收70bp-10kb的，但是回收的小片段很清楚但大片段是弥散的，所以采用的酚氯仿回收，我不知道是我操作的原因还是这个试剂盒不能回收我的大片段载体。
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科研无止境，我心成蹉跎
10楼2015-01-12 16:37:53
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