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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 目的片段一端是粘性末端,一端是平末端与相应载体的连接如何提高效率?急!
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moshangchenx

金虫 (正式写手)
引用回帖:
17楼: Originally posted by yangzhx at 2015-01-13 16:49:34
可能是跑胶染料的问题，不知你用的什么染料。染料能和DNA结合，影响连接效率。建议更换染料或者减少加入的量。

我用的是EB
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科研无止境，我心成蹉跎
21楼2015-01-14 19:22:58
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SilenceYF

金虫 (正式写手)
头像不错

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我热爱我的热爱~~
22楼2015-01-14 19:32:57
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
moshangchenx(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-01-15 20:00:50
重新制备载体和克隆片段，试试分别酶切，先切低盐缓冲液的酶，做下乙醇沉淀，再在与第一次等体积或加倍体积的体系切另一个酶，不要一下切2种酶。胶回收不要在紫外下照太久，胶回收等试剂盒最后洗脱下来的时候，如果用水，pH要在8.0这样，如果不好把握，建议用1/10-1/2浓度的TE(pH=8.0)。感受态细胞的转化效率有没有10^6以上？质粒转出来要很多才大道高的转化效率，一般多估计还不一定达到。T4 DNA连接酶反应体系中可以加一点ATP，有助于提高连接效率，酶的使用量按照平端的来添加，建议使用含高浓度T4 DNA连接酶的快速连接酶。
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为什么
23楼2015-01-14 23:43:20
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jijianhuij

木虫 (小有名气)
感谢参与，应助指数 +1
豆哥: 应助指数-1, 不是应助 2016-02-21 21:28:49
技术贴去丁香园啊.其实做实验有问题才是好事

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24楼2015-01-15 00:17:44
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zergbloody

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
moshangchenx(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-15 20:01:01
使用solution I，然后你把载体和片段都做几个稀释的梯度，16度连试试，几个小时就ok。并不是回收后越浓越好。我试过稀释到几纳克的载体，可以连接上的，浓度大反而抑制连接效率。祝好！

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25楼2015-01-15 08:46:07
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科科2013

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by moshangchenx at 2015-01-12 10:13:07
我们老师很固执，他认为能做出来，是我能力不行，这两个位点是他设计的，可能是嫌我说他位点弄得不好吧，现在一说换位点，他就很生气，唉...

偷偷换吧，要不让他试试？
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26楼2015-01-15 11:10:21
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Love_8023

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

就是胶回收试剂盒，一般胶回收试剂盒都能用于纯化DNA产物

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27楼2015-01-15 13:42:30
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Love_8023

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

就是胶回收试剂盒，一般都能用于DNA产物的纯化

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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28楼2015-01-15 13:44:35
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Love_8023

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
20楼: Originally posted by moshangchenx at 2015-01-14 19:22:46
您好，请问直接过柱是用的什么柱子，有专门的试剂盒还是用胶回收试剂盒或者是提取基因组DNA的试剂盒里的柱子？...

就是胶回收试剂盒

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29楼2015-01-15 13:45:56
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sarah_lz

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
moshangchenx: 金币+2, ★有帮助 2015-01-15 16:19:45
建议用于连接的片段跑胶看一下大致浓度，以防你拿着不含片段的东西在做
其次你的载体过大，片段插入浓度需要控制比较低。
克服载体过大的另一个方法就是先换小一点的载体，连接测序成功后，得到纯度较高的目标片段，再与目标载体连接
另外 连上后太大了，超过10k了，转化也有困难，需要条件优化
祝好运
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30楼2015-01-15 15:28:44
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