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moshangchenx金虫 (正式写手)
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目的片段一端是粘性末端,一端是平末端与相应载体的连接如何提高效率?急!已有12人参与
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我最近在做一个片段与载体的连接构建一个质粒,连了很多次都没连上. 具体如下:我的目的片段一端是粘性末端(Spe I 酶切位点),一端是平末端(SMA I 酶切位点).片段是PCR后连在T载体上测序正确,双酶切效果可以切出两条相应大小的片段.载体是pDBLeu,内含Spe I 与SMA I 酶切位点.其双酶切出的片段与未酶切的片段有电泳大小的区别.目的片段与载体我都双酶切后进行胶回收用去离子水溶解.回收产物电泳可看到模糊条带. 我做了十几次片段与载体不同浓度的连接,Takara Solutiuon I 、TIANGEN的T4DNA连接酶进行16度过夜连接以及用PCR仪进行过夜变温连接,用未酶切的pDBLeu质粒做阳性对照.结果,阳性对照的平板上每次都产生很多菌落,但做连接的板上一个菌落都没有.载体双酶切后片段长9800多bp，目标片段为1800多bp。 做了很多次了都如此,都快做的没信心做下去了,有哪个大哥大姐给我一些建设性意见吗?多谢了!!! |
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