| 查看: 7179 | 回复: 32 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
moshangchenx金虫 (正式写手)
|
[求助]
目的片段一端是粘性末端,一端是平末端与相应载体的连接如何提高效率?急!已有12人参与
|
||
|
我最近在做一个片段与载体的连接构建一个质粒,连了很多次都没连上. 具体如下:我的目的片段一端是粘性末端(Spe I 酶切位点),一端是平末端(SMA I 酶切位点).片段是PCR后连在T载体上测序正确,双酶切效果可以切出两条相应大小的片段.载体是pDBLeu,内含Spe I 与SMA I 酶切位点.其双酶切出的片段与未酶切的片段有电泳大小的区别.目的片段与载体我都双酶切后进行胶回收用去离子水溶解.回收产物电泳可看到模糊条带. 我做了十几次片段与载体不同浓度的连接,Takara Solutiuon I 、TIANGEN的T4DNA连接酶进行16度过夜连接以及用PCR仪进行过夜变温连接,用未酶切的pDBLeu质粒做阳性对照.结果,阳性对照的平板上每次都产生很多菌落,但做连接的板上一个菌落都没有.载体双酶切后片段长9800多bp，目标片段为1800多bp。 做了很多次了都如此,都快做的没信心做下去了,有哪个大哥大姐给我一些建设性意见吗?多谢了!!! |
回复此楼» 猜你喜欢
为什么蛋白质氨基酸测定大家都测17种?
已经有5人回复
-
《灰分记：我与坩埚的“灰烬”之恋》
已经有3人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有180人回复
-
求助 食品检验工（基础知识），中国劳动社会出版社 电子版
已经有5人回复
-
胶体几丁质的结晶度？
已经有0人回复
-
诚挚招收全日制博士！！！中国农业科学院麻类研究所谭志坚研究员课题组招收博士
已经有2人回复
-
三甲基羟乙基丙二胺的合成路线
已经有5人回复
【答案】应助回帖
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
moshangchenx(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-01-15 20:00:50
感谢参与，应助指数 +1
moshangchenx(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-01-15 20:00:50
| 重新制备载体和克隆片段，试试分别酶切，先切低盐缓冲液的酶，做下乙醇沉淀，再在与第一次等体积或加倍体积的体系切另一个酶，不要一下切2种酶。胶回收不要在紫外下照太久，胶回收等试剂盒最后洗脱下来的时候，如果用水，pH要在8.0这样，如果不好把握，建议用1/10-1/2浓度的TE(pH=8.0)。感受态细胞的转化效率有没有10^6以上？质粒转出来要很多才大道高的转化效率，一般多估计还不一定达到。T4 DNA连接酶反应体系中可以加一点ATP，有助于提高连接效率，酶的使用量按照平端的来添加，建议使用含高浓度T4 DNA连接酶的快速连接酶。 |
23楼2015-01-14 23:43:20
moshangchenx
金虫 (正式写手)
- 应助: 2 (幼儿园)
- 金币: 1913.7
- 散金: 7
- 红花: 1
- 帖子: 345
- 在线: 69.2小时
- 虫号: 1573517
- 注册: 2012-01-11
- 专业: 认知科学
2楼2015-01-12 09:08:50
moshangchenx
金虫 (正式写手)
- 应助: 2 (幼儿园)
- 金币: 1913.7
- 散金: 7
- 红花: 1
- 帖子: 345
- 在线: 69.2小时
- 虫号: 1573517
- 注册: 2012-01-11
- 专业: 认知科学
3楼2015-01-12 09:18:38
4楼2015-01-12 10:00:14