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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助！小载体连大片段怎么连，求高手指点！
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孤鸿飘渺影

新虫 (小有名气)

[求助] 求助！小载体连大片段怎么连，求高手指点！

我一个4.2k的载体连接一个7k的片段，试了好几把都没连上。酶切位点是BspEⅠ和HindⅢ两个酶切位点。请各位高手支点招！多谢！
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1楼 2014-12-15 14:50:14
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邱玉信

禁虫 (小有名气)
感谢参与，应助指数 +1
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2楼2014-12-16 01:26:04
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gangouyang

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
调整 载体VS 插入片段 的比列，可以尝试把载体当插入片段，把插入片段当载体，连接时间加长，建议用NEB的连接酶，效率高一些。
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3楼2014-12-16 14:29:14
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孤鸿飘渺影

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by gangouyang at 2014-12-16 14:29:14
调整 载体VS 插入片段 的比列，可以尝试把载体当插入片段，把插入片段当载体，连接时间加长，建议用NEB的连接酶，效率高一些。

我试过把载体当插入片段，只不过载体上有筛选基因，连接转化后，皿上长满克隆，挑了七八十个，没有一个是阳性。
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4楼2014-12-16 14:48:19
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gangouyang

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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孤鸿飘渺影: 金币+60, ★★★很有帮助, 多谢您的建议，我已经连上了。是将7k的片段分两部分连上的。 2015-01-29 15:20:07
听你说的，初步判断你的情况是：载体没切干净，载体自连。顺便说一句：挑6个clone鉴定，如果没有阳性的话，就重来再切一次载体，最多挑10个。另外，你赏的10金币有点少，如果按照以下分析问题得以解决的话，至少20金币。
解决方案：
1.首先确定你的酶切位点所用的两个酶在载体上是不是靠得太近了，甚至有共用碱基的情况，如果是，请换酶切位点，因为你不可能拿到双切的空载体。如果你非要用这两个酶，办法也是有的，就不赘述了。
2.如果不是1这种情况，那么建议你重新切载体，先用HindIII切，胶回收后，再用BspEⅠ切，再胶回收，请勿做同时双酶切，因为HindIII在buffer2中活性是100%，在其他的buffer中活性不高，BspEⅠ在buffer3活性中是100%，在其他的buffer中活性不高。
3.按照以下说明操作：把载体当插入片段，把插入片段当载体，连接时间加长，建议用NEB的连接酶，效率高一些。
祝你赏我金币，谢谢！
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5楼2014-12-17 18:16:29
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孤鸿飘渺影

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by gangouyang at 2014-12-17 18:16:29
听你说的，初步判断你的情况是：载体没切干净，载体自连。顺便说一句：挑6个clone鉴定，如果没有阳性的话，就重来再切一次载体，最多挑10个。另外，你赏的10金币有点少，如果按照以下分析问题得以解决的话，至少20金 ...

多谢指点，事成后奉上60金币。顺便问一句，你们做酶切，体系是怎么样的，一般切多少小时。
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6楼2014-12-19 18:16:29
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