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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助！小载体连大片段怎么连，求高手指点！
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孤鸿飘渺影

新虫 (小有名气)

[求助] 求助！小载体连大片段怎么连，求高手指点！

我一个4.2k的载体连接一个7k的片段，试了好几把都没连上。酶切位点是BspEⅠ和HindⅢ两个酶切位点。请各位高手支点招！多谢！
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1楼 2014-12-15 14:50:14
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孤鸿飘渺影

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by gangouyang at 2014-12-16 14:29:14
调整 载体VS 插入片段 的比列，可以尝试把载体当插入片段，把插入片段当载体，连接时间加长，建议用NEB的连接酶，效率高一些。

我试过把载体当插入片段，只不过载体上有筛选基因，连接转化后，皿上长满克隆，挑了七八十个，没有一个是阳性。
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4楼2014-12-16 14:48:19
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孤鸿飘渺影

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by gangouyang at 2014-12-17 18:16:29
听你说的，初步判断你的情况是：载体没切干净，载体自连。顺便说一句：挑6个clone鉴定，如果没有阳性的话，就重来再切一次载体，最多挑10个。另外，你赏的10金币有点少，如果按照以下分析问题得以解决的话，至少20金 ...

多谢指点，事成后奉上60金币。顺便问一句，你们做酶切，体系是怎么样的，一般切多少小时。
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6楼2014-12-19 18:16:29
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