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强疏水性蛋白跑非变性蛋白电泳不易进胶 已有2人参与
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| 目标蛋白来源是细菌，菌体破碎高速离心得到粗提液。在用粗提液做疏水作用色谱时发现目标蛋白疏水性很强，洗脱时20mM的Tris都不能将明白蛋白洗脱下来，需要用超纯水才可以。将疏水作用色谱纯化用超纯水洗脱下来的包含木蛋白的部分收集，超滤浓缩到1mL左右。由于疏水色谱纯化的洗脱液几乎全是超纯水，所以添加20mM Tris（pH9.0），20mM NaCl，5%甘油，1mM PMSF（异丙醇溶解的100mM浓度的母液）。冰上平衡10分钟后上样做非变性蛋白电泳。蛋白电泳用37.5:1比例的胶配置，pH9.0。上层胶浓度为4%，下层胶浓度为6%。电泳初始20分钟电泳为100V，之后电泳为300V，持续2h。电泳结束后，根据目标蛋白活性染色，发现目标蛋白停留在上样槽底部，未进入胶体。如果将电泳仪的电极倒置后，则目标蛋白会进入电泳缓冲液。所以可以排除蛋白电荷的因素。是不是明白蛋白沉淀了啊？请各位专家给分析下吧，多谢啦！ |
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7楼2014-12-14 18:16:05
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【答案】应助回帖
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cisong: 金币+50, ★★★★★最佳答案, 应该是你所说的那种情况，目标蛋白跟细胞壁连在一起了。谢谢大牛！！！ 2014-12-14 18:21:03
cisong: 金币+50, ★★★★★最佳答案, 应该是你所说的那种情况，目标蛋白跟细胞壁连在一起了。谢谢大牛！！！ 2014-12-14 18:21:03
| 疏水性大到只能用纯水才能洗脱下来的蛋白质也是能跑胶的，跑不进去可能是等电点太高，在pH9.0的时候不带多少电荷就不动了。我也有一个蛋白质在pH8.0几乎不进胶的，正常。 |
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3楼2014-12-10 01:25:33
4楼2014-12-14 15:19:00