应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 强疏水性蛋白跑非变性蛋白电泳不易进胶
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
71/1返回列表
查看: 1779  |  回复: 6
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

cisong

银虫 (小有名气)

[求助] 强疏水性蛋白跑非变性蛋白电泳不易进胶 已有2人参与

目标蛋白来源是细菌，菌体破碎高速离心得到粗提液。在用粗提液做疏水作用色谱时发现目标蛋白疏水性很强，洗脱时20mM的Tris都不能将明白蛋白洗脱下来，需要用超纯水才可以。将疏水作用色谱纯化用超纯水洗脱下来的包含木蛋白的部分收集，超滤浓缩到1mL左右。由于疏水色谱纯化的洗脱液几乎全是超纯水，所以添加20mM Tris（pH9.0），20mM NaCl，5%甘油，1mM PMSF（异丙醇溶解的100mM浓度的母液）。冰上平衡10分钟后上样做非变性蛋白电泳。蛋白电泳用37.5:1比例的胶配置，pH9.0。上层胶浓度为4%，下层胶浓度为6%。电泳初始20分钟电泳为100V，之后电泳为300V，持续2h。电泳结束后，根据目标蛋白活性染色，发现目标蛋白停留在上样槽底部，未进入胶体。如果将电泳仪的电极倒置后，则目标蛋白会进入电泳缓冲液。所以可以排除蛋白电荷的因素。是不是明白蛋白沉淀了啊？请各位专家给分析下吧，多谢啦！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
科研工作者
1楼 2014-11-25 19:28:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

嘿小杨同志

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
cisong: 金币+10, ★★★很有帮助, 谢谢，我试着提高下甘油的浓度 2014-12-14 18:19:42
蛋白漂起来了，没有进入胶内。楼主可以加大甘油的量，我做非变性蛋白电泳的时候，将甘油的比例提高为50%，基本上所有的蛋白都可以进入胶内跑出来。希望对楼主有用吧。
赞一下 回复此楼
2楼2014-12-09 17:22:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
cisong: 金币+50, ★★★★★最佳答案, 应该是你所说的那种情况，目标蛋白跟细胞壁连在一起了。谢谢大牛！！！ 2014-12-14 18:21:03
疏水性大到只能用纯水才能洗脱下来的蛋白质也是能跑胶的，跑不进去可能是等电点太高，在pH9.0的时候不带多少电荷就不动了。我也有一个蛋白质在pH8.0几乎不进胶的，正常。
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

cisong
流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
3楼2014-12-10 01:25:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cisong

银虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2014-12-10 01:25:33
疏水性大到只能用纯水才能洗脱下来的蛋白质也是能跑胶的，跑不进去可能是等电点太高，在pH9.0的时候不带多少电荷就不动了。我也有一个蛋白质在pH8.0几乎不进胶的，正常。

谢谢你的回复。等电点这个问题可能不是我这个蛋白不进胶的原因，因为我还跑过pH10.0的native PAGE，还是不进胶。另外，在我用疏水色谱纯化得到的部分纯化样来跑Blue native PAGE时，进胶的蛋白不少，但是目标蛋白却进胶，总是留在上样槽的底部。是不是因为我的蛋白是革兰氏阳性菌与膜相连的蛋白，压力破碎时虽然下来了，但是跟部分细胞壁连在一起啊？
赞一下 回复此楼
科研工作者
4楼2014-12-14 15:19:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
引用回帖:
4楼: Originally posted by cisong at 2014-12-14 15:19:00
谢谢你的回复。等电点这个问题可能不是我这个蛋白不进胶的原因，因为我还跑过pH10.0的native PAGE，还是不进胶。另外，在我用疏水色谱纯化得到的部分纯化样来跑Blue native PAGE时，进胶的蛋白不少，但是目标蛋白却 ...

等电点或者跟部分细胞壁连在一起都有可能，但我还是觉得等电点比较可能，因为假如跟部分细胞壁连在一起，过柱的时候不堵？
赞一下(1人) 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

cisong
流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
5楼2014-12-14 15:47:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cisong

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2014-12-14 15:47:26
等电点或者跟部分细胞壁连在一起都有可能，但我还是觉得等电点比较可能，因为假如跟部分细胞壁连在一起，过柱的时候不堵？...

你分析的非常到位。应该是这部分纯化的蛋白之所以疏水性很强，是因为跟细胞壁连在一起，因为在用粗提液跑胶时，部分明白蛋白能进胶，部分不能进胶，这部分不能进胶的的原因应该就是跟细胞壁连着，今天刚刚想通了，刚用更高压力1800bar破碎了6遍，这样的话，跟细胞壁相连的部分就会少的可以忽略不计，绝大部分目标蛋白都是可溶的了。晚上再做一次疏水纯化的梯度洗脱，看看是不是猜想的这样。我觉得应该就是这样！
赞一下 回复此楼
科研工作者
6楼2014-12-14 18:14:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cisong

银虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
5楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2014-12-14 15:47:26
等电点或者跟部分细胞壁连在一起都有可能，但我还是觉得等电点比较可能，因为假如跟部分细胞壁连在一起，过柱的时候不堵？...

另外，我之前做过用疏水纯化的样品做离子交换，结果目标蛋白死活检测不到，估计就是堵在柱子上了。疏水柱的间隙比目标蛋白大，而离子交换色谱的柱子间隙小于目标蛋白。
赞一下 回复此楼
科研工作者
7楼2014-12-14 18:16:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 cisong 的主题更新
71/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 085600，321分求调剂 +13 大馋小子 2026-04-04 14/700 2026-04-06 12:47 by barlinike
[考研] 求调剂，一志愿郑州大学材料与化工专硕，英二数二342分，求老师收留 +19 v12abo 2026-04-02 21/1050 2026-04-06 09:29 by 蓝云思雨
[考研] 304求调剂 +7 c297914 2026-04-05 8/400 2026-04-05 22:13 by hemengdong
[考研] 复试调剂 +8 春日来信- 2026-04-03 8/400 2026-04-05 18:58 by 蓝云思雨
[考研] 一志愿北京交通大学材料工程总分358求调剂 +4 cs0106 2026-04-04 4/200 2026-04-05 18:46 by imissbao
[考研] 一志愿 南京航空航天大学 ，080500材料科学与工程学硕 +10 @taotao 2026-03-30 10/500 2026-04-05 17:57 by jj987
[考研] 材料工程310专硕调剂 +13 捞捞我…. 2026-04-04 14/700 2026-04-05 09:01 by 来看流星雨10
[考研] 290求调剂 +7 luoziheng 2026-04-04 7/350 2026-04-04 23:17 by lqwchd
[考研] 292分，材料与化工，申请调剂 +22 程晴之 2026-04-01 26/1300 2026-04-04 22:03 by hemengdong
[考研] 321求调剂 +13 认真求上学 2026-04-02 13/650 2026-04-04 18:23 by macy2011
[考研] 总分328生物与医药考数学求调剂 +7 aaadim 2026-04-02 9/450 2026-04-03 22:53 by syh9288
[考研] 化工求调剂 +11 荔香芝士椰奶 2026-04-03 11/550 2026-04-03 22:06 by 啵啵啵0119
[考研] 283求调剂 +3 jiouuu 2026-04-03 4/200 2026-04-03 13:28 by jiouuu
[考研] 一志愿华东理工大学，080500学硕，317分，求调剂 +13 s1145 2026-03-31 15/750 2026-04-03 11:44 by msi123
[基金申请] 请问共同通讯和共同一作的认可度问题 10+4 psa1234 2026-04-01 10/500 2026-04-03 11:08 by Kittylucky
[考研] 316求调剂 +14 舟自梗 2026-04-01 18/900 2026-04-03 10:28 by linyelide
[考研] 302求调剂 +9 zyx上岸！ 2026-04-02 9/450 2026-04-02 23:07 by 马儿快快地跑
[考研] 调剂 +3 好好读书。 2026-04-01 6/300 2026-04-02 15:49 by liumengping
[考研] 0710生物学，325求调剂 +3 mkkkkkl 2026-04-01 3/150 2026-04-02 09:48 by Jaylen.
[考研] 279求调剂 +7 莫xiao 2026-04-01 7/350 2026-04-01 22:05 by 客尔美德
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭