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cisong

银虫 (小有名气)

[求助] 强疏水性蛋白跑非变性蛋白电泳不易进胶 已有2人参与

目标蛋白来源是细菌，菌体破碎高速离心得到粗提液。在用粗提液做疏水作用色谱时发现目标蛋白疏水性很强，洗脱时20mM的Tris都不能将明白蛋白洗脱下来，需要用超纯水才可以。将疏水作用色谱纯化用超纯水洗脱下来的包含木蛋白的部分收集，超滤浓缩到1mL左右。由于疏水色谱纯化的洗脱液几乎全是超纯水，所以添加20mM Tris（pH9.0），20mM NaCl，5%甘油，1mM PMSF（异丙醇溶解的100mM浓度的母液）。冰上平衡10分钟后上样做非变性蛋白电泳。蛋白电泳用37.5:1比例的胶配置，pH9.0。上层胶浓度为4%，下层胶浓度为6%。电泳初始20分钟电泳为100V，之后电泳为300V，持续2h。电泳结束后，根据目标蛋白活性染色，发现目标蛋白停留在上样槽底部，未进入胶体。如果将电泳仪的电极倒置后，则目标蛋白会进入电泳缓冲液。所以可以排除蛋白电荷的因素。是不是明白蛋白沉淀了啊？请各位专家给分析下吧，多谢啦！
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科研工作者
1楼 2014-11-25 19:28:07
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嘿小杨同志

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
cisong: 金币+10, ★★★很有帮助, 谢谢，我试着提高下甘油的浓度 2014-12-14 18:19:42
蛋白漂起来了，没有进入胶内。楼主可以加大甘油的量，我做非变性蛋白电泳的时候，将甘油的比例提高为50%，基本上所有的蛋白都可以进入胶内跑出来。希望对楼主有用吧。
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2楼2014-12-09 17:22:35
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

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cisong: 金币+50, ★★★★★最佳答案, 应该是你所说的那种情况，目标蛋白跟细胞壁连在一起了。谢谢大牛！！！ 2014-12-14 18:21:03
疏水性大到只能用纯水才能洗脱下来的蛋白质也是能跑胶的，跑不进去可能是等电点太高，在pH9.0的时候不带多少电荷就不动了。我也有一个蛋白质在pH8.0几乎不进胶的，正常。
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cisong
流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
3楼2014-12-10 01:25:33
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cisong

银虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2014-12-10 01:25:33
疏水性大到只能用纯水才能洗脱下来的蛋白质也是能跑胶的，跑不进去可能是等电点太高，在pH9.0的时候不带多少电荷就不动了。我也有一个蛋白质在pH8.0几乎不进胶的，正常。

谢谢你的回复。等电点这个问题可能不是我这个蛋白不进胶的原因，因为我还跑过pH10.0的native PAGE，还是不进胶。另外，在我用疏水色谱纯化得到的部分纯化样来跑Blue native PAGE时，进胶的蛋白不少，但是目标蛋白却进胶，总是留在上样槽的底部。是不是因为我的蛋白是革兰氏阳性菌与膜相连的蛋白，压力破碎时虽然下来了，但是跟部分细胞壁连在一起啊？
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科研工作者
4楼2014-12-14 15:19:00
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
引用回帖:
4楼: Originally posted by cisong at 2014-12-14 15:19:00
谢谢你的回复。等电点这个问题可能不是我这个蛋白不进胶的原因，因为我还跑过pH10.0的native PAGE，还是不进胶。另外，在我用疏水色谱纯化得到的部分纯化样来跑Blue native PAGE时，进胶的蛋白不少，但是目标蛋白却 ...

等电点或者跟部分细胞壁连在一起都有可能，但我还是觉得等电点比较可能，因为假如跟部分细胞壁连在一起，过柱的时候不堵？
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cisong
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5楼2014-12-14 15:47:26
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cisong

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2014-12-14 15:47:26
等电点或者跟部分细胞壁连在一起都有可能，但我还是觉得等电点比较可能，因为假如跟部分细胞壁连在一起，过柱的时候不堵？...

你分析的非常到位。应该是这部分纯化的蛋白之所以疏水性很强，是因为跟细胞壁连在一起，因为在用粗提液跑胶时，部分明白蛋白能进胶，部分不能进胶，这部分不能进胶的的原因应该就是跟细胞壁连着，今天刚刚想通了，刚用更高压力1800bar破碎了6遍，这样的话，跟细胞壁相连的部分就会少的可以忽略不计，绝大部分目标蛋白都是可溶的了。晚上再做一次疏水纯化的梯度洗脱，看看是不是猜想的这样。我觉得应该就是这样！
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科研工作者
6楼2014-12-14 18:14:23
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cisong

银虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
5楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2014-12-14 15:47:26
等电点或者跟部分细胞壁连在一起都有可能，但我还是觉得等电点比较可能，因为假如跟部分细胞壁连在一起，过柱的时候不堵？...

另外，我之前做过用疏水纯化的样品做离子交换，结果目标蛋白死活检测不到，估计就是堵在柱子上了。疏水柱的间隙比目标蛋白大，而离子交换色谱的柱子间隙小于目标蛋白。
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科研工作者
7楼2014-12-14 18:16:05
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