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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 荧光定量PCR标准曲线的问题
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yajune

铁杆木虫 (职业作家)

[求助] 荧光定量PCR标准曲线的问题 已有2人参与

投了篇毒理学的文章，审稿人提出了关于荧光定量PCR的优化问题，我的QPCR就是按照试剂盒进行的，就是所有测的基因都按照一个扩增方法（试剂盒推荐的）就都能扩出来，所以可能也不需要优化吧。但是关于标准曲线的问题，我有点不明白，我的QPCR做的是相对定量，也就是把对照组当作1，然后计算处理组的相对表达值；这种半定量也需要标准曲线么？还是说审稿人指的是扩增曲线呢？下边是审稿人的原话，麻烦比较懂得同学帮我分析一下，谢谢啦
How were the QPCR assays optimised: no details are currently given and the authors state everything was run at the same temperature. What was the efficiency and correlation coefficient for the standard curves in each case? If appropriate validation was not conducted the dataset is not valid. If this was conducted, please add details to the supplemental table.

另外审稿人还提了一个选择内参基因的问题，我用的是beta-actin，但是审稿人貌似觉得这个内参不合适。。。问我是如何证明它的表达是稳定的，这个问题我还真没考虑过，因为我是看大部分文献都以beta-actin为内参，我就理所当然的用了这个，请问一下这个问题从技术上讲有比较好的解决办法么？或者说有什么比较好的回答方法么？
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1楼 2014-10-15 13:34:19
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xiemin217

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
意见很中肯吧，是需要给他提供标准曲线数据的

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2014-10-16 10:04:19
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
yajune(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-10-16 14:58:15
做相对定量需要制备标准曲线，标准曲线的目的是证明你的两个基因扩增效率差不多，这主要有标准曲线的斜率，相关系数和扩增效率来证明的，如果你的两个基因的扩增效率差别很大，实验数据是不可靠的
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rainwater
3楼2014-10-16 10:16:44
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yajune

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-10-16 10:16:44
做相对定量需要制备标准曲线，标准曲线的目的是证明你的两个基因扩增效率差不多，这主要有标准曲线的斜率，相关系数和扩增效率来证明的，如果你的两个基因的扩增效率差别很大，实验数据是不可靠的

那如果我的目的基因做了20个，我是只需要做一次内参基因的标准曲线，还是需要做20次呢，还是说每一板做一次，希望您能继续解惑，谢谢
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4楼2014-10-17 01:36:25
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