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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 蛋白印记封闭液稀释液问题
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lianchen1218

金虫 (正式写手)

[求助] 蛋白印记封闭液稀释液问题 已有1人参与

开始做蛋白印记一年了，最近才发现有个步骤搞错了，之前是medium配方搞错了好几个月，实验就在各种重复中缓慢进行，真心觉得自己真不适合搞科研。
想问各位大侠，我用的5%的牛奶封闭液，应该是用TBST配置牛奶，而我一直用的蒸馏水来配置，封闭和二抗孵育都是用的蒸馏水配置的牛奶作为稀释液，实验室有个博后说这样会影响实验结果，我也不知道会有多大影响，我的膜显色出来也没有高背景。请大家帮忙指点分析一下，这样做的后果有多严重，谢谢！
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勇敢一点，去充实自己
1楼 2014-10-02 17:32:43
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ssssllllnnnn

至尊木虫 (知名作家)

Translator and Proofreader

【答案】应助回帖

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感谢参与，应助指数 +1
lianchen1218: 金币+30, ★★★★★最佳答案 2014-10-03 15:24:18
Western blot就是利用抗原和抗体特异性相互作用的特点进行的，基础是蛋白与蛋白之间的特异性相互作用，这种作用是需要一定条件的，主要的条件之一就是盐的浓度。盐浓度太高或太低都不利于这种相互作用。正常情况下，blocking过程以及后续的一抗、二抗孵育过程都需要在这种合适条件下进行，所以需要在TBST或者其他类似缓冲液中进行（如PBST等）。如果你直接用水代替缓冲液，我想结果一定不理想，因为没有提高合适的条件。不理想的结果应该主要是得不到特异性信号，如果抗体好而且蛋白表达高，兴许也可以得到一些弱信号。至于background，那要一定是很干净的：在这么差的条件下，蛋白之间的非特异性结合恐怕很难的，所以你的blot应该很干净，乃至特异性信号都没有或者非常弱。
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2楼2014-10-02 23:20:43
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lianchen1218

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ssssllllnnnn at 2014-10-02 23:20:43
Western blot就是利用抗原和抗体特异性相互作用的特点进行的，基础是蛋白与蛋白之间的特异性相互作用，这种作用是需要一定条件的，主要的条件之一就是盐的浓度。盐浓度太高或太低都不利于这种相互作用。正常情况下， ...

这可能也是我有一些信号始终很弱的原因，谢谢你的回复，很有用
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勇敢一点，去充实自己
3楼2014-10-03 15:24:00
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