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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 就要被免疫荧光折磨疯了，大侠啊，求救啊！！！
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shwkx1987

新虫 (小有名气)

[交流] 就要被免疫荧光折磨疯了，大侠啊，求救啊！！！

从上学期开始做间接免疫荧光，染得是细胞角蛋白骨架。刚开始荧光太弱，摸索了好一阵子，这学期初终于能染好了。可从四月中开始，固定这一步出现了致命的问题，至今找不到好的解决办法。不知有没有有经验的同学可以指点一下啊
  我之前一直用的是-20度遇冷的100%甲醇在-20度固定十分钟，效果还好。可现在固定五分钟细胞就都收缩甚至直接就脱片了，实在不知道为何啊。用4%甲醛、多聚甲醛固定细胞都不会收缩，但严重影响抗体的结合，荧光极弱。
    现在是实验的关键阶段，出现这样的问题，就如晴天霹雳，这段时间快痛苦死了。求救啊！！！！
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1楼2012-05-29 21:37:52
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肖颖2009

铁虫 (正式写手)
★
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是不是细胞状态不好啊，先把细胞状态调整好再说吧~
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2楼2012-05-30 11:12:07
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庹儿_1977

铜虫 (小有名气)
再接再厉
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3楼2012-05-30 11:18:15
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shwkx1987

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 肖颖2009 at 2012-05-30 11:12:07
是不是细胞状态不好啊，先把细胞状态调整好再说吧~

我也想到了，复苏了新的还是一样
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4楼2012-05-30 12:13:53
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废哥117

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你试一下用4%多聚甲醛固定然后再用甲醇固定
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5楼2012-05-30 13:32:13
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yushenye

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
“用4%甲醛、多聚甲醛固定细胞都不会收缩，但严重影响抗体的结合，荧光极弱。”
应该是你没有透化好吧
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8楼2012-05-30 16:28:29
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xiaohaizi0220

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
很理解你。愿你早日摸索出解决的办法
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9楼2012-05-30 17:20:03
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shwkx1987

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by yushenye at 2012-05-30 16:28:29
“用4%甲醛、多聚甲醛固定细胞都不会收缩，但严重影响抗体的结合，荧光极弱。”
应该是你没有透化好吧

我在固定液中没加triton-x100，只是在封闭液和抗体稀释液中含有。是不是需要加一步透化处理呢或者抗原修复
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10楼2012-05-30 17:59:23
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yuanyisuo

金虫 (小有名气)
冷丙酮试试呢
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11楼2012-05-31 07:56:04
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小神-小神

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
shwkx1987: 金币+3 2012-05-31 16:53:33
引用回帖:
10楼: Originally posted by shwkx1987 at 2012-05-30 17:59:23
我在固定液中没加triton-x100，只是在封闭液和抗体稀释液中含有。是不是需要加一步透化处理呢或者抗原修复...

固定液中没加triton-x100？那么您的操作步骤是什么呢？
我是用4%多聚甲醛固定15-30min后，PBS洗3-4次（每次5min）；
接下来用0.1%triton-x100透化15-30min，再用PBS洗3次。
再加含有BSA的PBS溶解一抗冰箱孵育过夜，同时实现封闭。
也就是说，固定、透化是有单独操作的，而封闭没有。
看你这个回复的意思是……你没有单独透化的操作？
这也许就是荧光强度弱的原因。
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12楼2012-05-31 08:50:03
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小神-小神

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
另外补充一点，如果目标蛋白不是细胞膜蛋白，那么都需要透化的。
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13楼2012-05-31 09:02:06
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shwkx1987

新虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 小神-小神 at 2012-05-31 08:50:03
固定液中没加triton-x100？那么您的操作步骤是什么呢？
我是用4%多聚甲醛固定15-30min后，PBS洗3-4次（每次5min）；
接下来用0.1%triton-x100透化15-30min，再用PBS洗3次。
再加含有BSA的PBS溶解一抗冰箱孵育过 ...

非常感谢您。我是用甲醛固定之后，直接封闭。在封闭液中含有0.2%的triton-x100。我再试试您说的。
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14楼2012-05-31 16:47:00
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shwkx1987

新虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 小神-小神 at 2012-05-31 09:02:06
另外补充一点，如果目标蛋白不是细胞膜蛋白，那么都需要透化的。

我现在搞不懂，为什么现在用甲醇固定细胞就脱片了，之前一直都挺好的啊
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15楼2012-05-31 16:48:06
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shwkx1987

新虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by yuanyisuo at 2012-05-31 07:56:04
冷丙酮试试呢

我再试试。谢谢您！
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16楼2012-05-31 16:49:04
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zmeng

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
“只是在封闭液和抗体稀释液中含有。是不是需要加一步透化处理呢或者抗原修复”
我觉得问题出现在这里，triton-x100是一种表面活性剂，你用来浮抗体应该是结合不好的。我的经验是4%多聚甲醛固定好了以后，0.5%的triton-x100或者NP-40通透30min,然后PBS洗3次，封闭，孵育抗体。或许会好一点
仅个人经验
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17楼2012-06-06 17:36:02
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shwkx1987

新虫 (小有名气)
引用回帖:
17楼: Originally posted by zmeng at 2012-06-06 17:36:02
“只是在封闭液和抗体稀释液中含有。是不是需要加一步透化处理呢或者抗原修复”
我觉得问题出现在这里，triton-x100是一种表面活性剂，你用来浮抗体应该是结合不好的。我的经验是4%多聚甲醛固定好了以后，0.5%的tr ...

我试过了，荧光还是弱
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18楼2012-06-12 11:37:50
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zmeng

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
换二抗试试，用PE标记的会亮一点
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19楼2012-06-13 14:30:56
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min-ustc6楼
2012-05-30 13:56   回复  
yanjunnan7楼
2012-05-30 16:17   回复  
hao
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