[交流] 就要被免疫荧光折磨疯了，大侠啊，求救啊！！！

从上学期开始做间接免疫荧光，染得是细胞角蛋白骨架。刚开始荧光太弱，摸索了好一阵子，这学期初终于能染好了。可从四月中开始，固定这一步出现了致命的问题，至今找不到好的解决办法。不知有没有有经验的同学可以指点一下啊
我之前一直用的是-20度遇冷的100%甲醇在-20度固定十分钟，效果还好。可现在固定五分钟细胞就都收缩甚至直接就脱片了，实在不知道为何啊。用4%甲醛、多聚甲醛固定细胞都不会收缩，但严重影响抗体的结合，荧光极弱。
现在是实验的关键阶段，出现这样的问题，就如晴天霹雳，这段时间快痛苦死了。求救啊！！！！

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1楼 2012-05-29 21:37:52

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木虫 (正式写手)

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shwkx1987: 金币+3 2012-05-31 16:53:33

引用回帖:

10楼: Originally posted by shwkx1987 at 2012-05-30 17:59:23
我在固定液中没加triton-x100，只是在封闭液和抗体稀释液中含有。是不是需要加一步透化处理呢或者抗原修复...

固定液中没加triton-x100？那么您的操作步骤是什么呢？
我是用4%多聚甲醛固定15-30min后，PBS洗3-4次（每次5min）；
接下来用0.1%triton-x100透化15-30min，再用PBS洗3次。
再加含有BSA的PBS溶解一抗冰箱孵育过夜，同时实现封闭。
也就是说，固定、透化是有单独操作的，而封闭没有。
看你这个回复的意思是……你没有单独透化的操作？
这也许就是荧光强度弱的原因。