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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】转染后的Hela S3行免疫荧光后在显微镜下观察，无图像，失败原因探讨。
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qian_me

[交流] 【求助/交流】转染后的Hela S3行免疫荧光后在显微镜下观察，无图像，失败原因探讨。 已有5人参与

我是分子生物实验新手，今天对转染后的Hela S3进行免疫荧光，然后在显微镜下观察，任何细胞的影子都没有，觉得奇怪的地方是，我想不出原因，因为此前进行两次类似的实验都有细胞成像，这次步骤上完全是重复以往的，除了转染的基因不同以外，其他都一样。上周五对细胞进行固定，分别应用4%PFA, 0.5% Triton X-20, 1% Perfect Blocking，进行固定，后存入冰箱冷藏，这周一开始加一抗和二抗，以及核染色。此前做过两次，步骤相同，都获成功，此次失败不知有哪些原因可以导致，请高手们指教！多谢！
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1楼 2010-08-16 21:32:34
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qian_me

补充下，转染的基因对细胞无毒性，转染后细胞生长速度和形态均正常，固定前观察细胞均是正常状态。细胞的密度大概达80%～90%。
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2楼2010-08-16 21:34:57
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sandra2128

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
你是不是显微镜没调好啊？荧光开关没开吧？
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静而后能安；安而后能思；思而后能得。
3楼2010-08-17 07:27:09
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qian_me

呵呵，谢谢这位回帖的朋友～
原因解开了，为了不给初学者带来困扰，我赶紧来自行了断下！
其实是这次质粒TAG不同，所以一抗和二抗不一样，就是说抗体加错了～
都怪带我的那个老师急于放假，加之语言不通，他放假前就没有告诉我，而作为接触实验不到2个月真正的初学者，也没想到要注意抗体，没有去主动问老师。
看来语言太重要，好好学英语，好好学日语！有问题随时问，啥问题想到都问！
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4楼2010-08-23 13:41:08
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henkally

禁虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
本帖内容被屏蔽
5楼2010-08-23 13:52:51
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sikao

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
qian_me
您好！我准备做细胞的免疫荧光试验，但是细胞已经收集冻上了，请问该怎样制备细胞玻片，用什么固定剂呢，免疫荧光染色剂用什么呢？
谢谢啦！
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6楼2012-03-21 20:53:27
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十三-小样

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
复苏细胞，培养直传代，六孔板爬片
4%PFA固定
我用的Alexa fluor 488
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走好眼前每一步
7楼2012-06-12 11:14:24
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十三-小样

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2450656楼: Originally posted by sikao at 2012-03-21 20:53:27
qian_me
您好！我准备做细胞的免疫荧光试验，但是细胞已经收集冻上了，请问该怎样制备细胞玻片，用什么固定剂呢，免疫荧光染色剂用什么呢？
谢谢啦！

复苏细胞，培养直传代，六孔板爬片
4%PFA固定
我用的Alexa fluor 488
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走好眼前每一步
8楼2012-06-12 11:14:50
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