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qian_me

[交流] 【求助/交流】转染后的Hela S3行免疫荧光后在显微镜下观察,无图像,失败原因探讨。 已有5人参与

我是分子生物实验新手,今天对转染后的Hela S3进行免疫荧光,然后在显微镜下观察,任何细胞的影子都没有,觉得奇怪的地方是,我想不出原因,因为此前进行两次类似的实验都有细胞成像,这次步骤上完全是重复以往的,除了转染的基因不同以外,其他都一样。上周五对细胞进行固定,分别应用4%PFA, 0.5% Triton X-20, 1% Perfect Blocking,进行固定,后存入冰箱冷藏,这周一开始加一抗和二抗,以及核染色。此前做过两次,步骤相同,都获成功,此次失败不知有哪些原因可以导致,请高手们指教!多谢!
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qian_me

补充下,转染的基因对细胞无毒性,转染后细胞生长速度和形态均正常,固定前观察细胞均是正常状态。细胞的密度大概达80%~90%。
2楼2010-08-16 21:34:57
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sandra2128

金虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
你是不是显微镜没调好啊?荧光开关没开吧?
静而后能安;安而后能思;思而后能得。
3楼2010-08-17 07:27:09
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qian_me

呵呵,谢谢这位回帖的朋友~
原因解开了,为了不给初学者带来困扰,我赶紧来自行了断下!
其实是这次质粒TAG不同,所以一抗和二抗不一样,就是说抗体加错了~
都怪带我的那个老师急于放假,加之语言不通,他放假前就没有告诉我,而作为接触实验不到2个月真正的初学者,也没想到要注意抗体,没有去主动问老师。
看来语言太重要,好好学英语,好好学日语!有问题随时问,啥问题想到都问!
4楼2010-08-23 13:41:08
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henkally

禁虫 (著名写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
本帖内容被屏蔽

5楼2010-08-23 13:52:51
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sikao

铜虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
qian_me
您好!我准备做细胞的免疫荧光试验,但是细胞已经收集冻上了,请问该怎样制备细胞玻片,用什么固定剂呢,免疫荧光染色剂用什么呢?
谢谢啦!
6楼2012-03-21 20:53:27
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十三-小样

铜虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
复苏细胞,培养直传代,六孔板爬片
4%PFA固定
我用的Alexa fluor 488
走好眼前每一步
7楼2012-06-12 11:14:24
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十三-小样

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2450656楼: Originally posted by sikao at 2012-03-21 20:53:27
qian_me
您好!我准备做细胞的免疫荧光试验,但是细胞已经收集冻上了,请问该怎样制备细胞玻片,用什么固定剂呢,免疫荧光染色剂用什么呢?
谢谢啦!

复苏细胞,培养直传代,六孔板爬片
4%PFA固定
我用的Alexa fluor 488
走好眼前每一步
8楼2012-06-12 11:14:50
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