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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » Taqman荧光定量PCR跑出来的曲线出现了各种问题，不知问题出在哪儿
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胡琴HuQin

新虫 (小有名气)

[求助] Taqman荧光定量PCR跑出来的曲线出现了各种问题，不知问题出在哪儿 已有3人参与

本人最近在做探针法荧光定量RT-PCR,但是跑出来的图形各种奇怪。我不知道问题出在了哪里，该怎样分析和改进？望善良智慧的虫友们能帮我分析分析，提提意见！我在此谢谢大家了！

Taqman荧光定量PCR跑出来的曲线出现了各种问题，不知问题出在哪儿
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1楼 2014-09-23 21:57:16
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xipha

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
胡琴HuQin(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-24 09:16:29
你用的什么酶啊? 怎么扩得这么快,然后低拷贝的标准品都扩不出来(你的标准是5个点还是6个, 怎么看起来只有3个标准? 你的重复3次的标准点是哪个?).
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2楼2014-09-24 01:24:28
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胡琴HuQin

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xipha at 2014-09-24 01:24:28
你用的什么酶啊? 怎么扩得这么快,然后低拷贝的标准品都扩不出来(你的标准是5个点还是6个, 怎么看起来只有3个标准? 你的重复3次的标准点是哪个?).

我是一步法荧光定量RT-PCR.图中是设了8个模版浓度梯度，没有设置重复。用的宝生物一步法试剂盒。我觉得自己图中曲线还有问题，就是荧光值怎么那么低呢？还有就是我想请问一下FAM标记的荧光探针溶于稀释液后是什么溶液是什么颜色啊？是浅棕色的吗？
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3楼2014-09-24 07:15:19
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xipha

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
胡琴HuQin: 金币+3 2014-09-24 20:09:42
引用回帖:
3楼: Originally posted by 胡琴HuQin at 2014-09-24 07:15:19
我是一步法荧光定量RT-PCR.图中是设了8个模版浓度梯度，没有设置重复。用的宝生物一步法试剂盒。我觉得自己图中曲线还有问题，就是荧光值怎么那么低呢？还有就是我想请问一下FAM标记的荧光探针溶于稀释液后是什么溶 ...

不好意思我没有用过FAM标记. 这个图看着有点摸不着头脑,也不知道是哪里的问题. 不过你的样品如果在标准曲线的线性区那也就无所谓了,另外你能把扩增效率曲线做一下看看扩增效率么(Ct/quantity)?还有就是如果低浓度的标曲拉不开的话,你批一个高浓度系列的表曲试试扩增效率. 看看是不是就是目标浓度低于检测体系灵敏度了. 不过一般做低浓度标曲都会有一个起飞Ct高于25的标准点的.
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4楼2014-09-24 10:32:26
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胡琴HuQin

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by xipha at 2014-09-24 10:32:26
不好意思我没有用过FAM标记. 这个图看着有点摸不着头脑,也不知道是哪里的问题. 不过你的样品如果在标准曲线的线性区那也就无所谓了,另外你能把扩增效率曲线做一下看看扩增效率么(Ct/quantity)?还有就是如果低浓度的 ...

嗯，谢谢！
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5楼2014-09-24 20:09:24
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love_st

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
胡琴HuQin(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-11-20 12:02:01
也没看出来你的问题在哪里，你的问题出现在哪里
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6楼2014-11-20 11:46:50
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happydove

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

做定量 一定要设置重复
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7楼2014-11-20 13:30:30
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