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diguoxueye

金虫 (正式写手)

[交流] 测定CAT活力的问题 已有1人参与

我在测定蔬菜CAT活力时发现,测定的吸光值先下降,后来有一两个点上升,然后接着陡然下降,就是在异常点的前后的数据分别符合吸光值随时间而下降。我测定酶活力之前做过酶的预热。请问有谁知道为什么会有异常值的出现。
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小毛孩24

专家顾问 (职业作家)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
建议放上具体的方法和操作的过程
2楼2014-09-12 09:28:24
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diguoxueye

金虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 小毛孩24 at 2014-09-12 09:28:24
建议放上具体的方法和操作的过程

您好。我采用的测定方法如下:
试剂
0.1mol/L pH 7.5磷酸钠缓冲液;50mmol/L pH 7.5磷酸钠缓冲液;
提取缓冲液(含5mmol/L DTT和5% PVP):称取5g PVP,用0.1mol/L pH 7.5 磷酸钠缓冲液溶解,定容至100mL,即得到所需提取缓冲液,低温(4℃)储藏备用。
20 mmol/L H2O2溶液:吸取227μL 的30% H2O2溶液,用50mmol/L磷酸钠缓冲液冲洗稀释至100mL,现配现用,低温避光保存。
实验步骤:
        酶液制备
称取5.0g果蔬样品,置于研钵中,加入5.0mL提取缓冲液,在冰浴条件下研磨成匀浆,于4℃、4000rpm离心20min,收集上清液,即为酶提取液。低温保存备用。
        活性测定
酶促反应体系由2.9 mL 20mmol/L H2O2溶液和100μL酶提取液组成。以蒸馏水为参比空白,在反应15s时开始记录反应体系在波长240mm处吸光值,作为初始值,然后每隔30s记录一次,连续测定,至少获取6个点的数据。
实验结果计算与处理
记录反应体系在波长240nm处的吸光度值,制作OD240值随时间变化曲线,根据曲线的初始线性部分计算每分钟吸光度变化值△OD240
        〖∆OD〗_240=(OD_240F-OD_240I)/(t_F-t_I)
式中 △OD240  —每分钟反应混合物吸光度值变化值;
     △OD240F —反应混合液吸光度终止值;
△OD240I —反应混合液吸光值初始值;
tF  —反应终止时间,min;
tI  —反应初始时间。
以每克蔬菜样品每分钟吸光值变化值减少0.01为1个过氧化氢酶活性单位,单位是0.01△OD240/(min*g)。计算公式:
U=〖∆OD〗_240*V/(0.01*V_s*m)
式中 V——样品提取液总体积,mL;
     Vs——测定时所取样品提取液体积,mL;
     M——样品质量,m。
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3楼2014-09-24 20:26:54
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