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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】分光光度计测出的吸光值如何计算CAT,APX,POD？
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liujie2008

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】分光光度计测出的吸光值如何计算CAT,APX,POD？

用分光光度计测的CAT,APX,POD,吸光值如何转换成CAT,APX,POD的值啊？是不是先做出吸光值的线性分析，求出斜率，然后再用蛋白/斜率求值吗？我做的线性分析怎么得出的斜率都是0呢？求高手指点。谢了
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1楼 2011-02-15 22:01:07
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凌波丽

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小丹木木: 金币+2 2012-05-02 13:33:33
光光度计法的过氧化氢酶活力计算公式（无法直接录入，请见附件）过氧化氢是在230nm，240nm有强吸收峰，不是290nm.

Nature Protocols(2010)MEASUREMENT OF SUPEROXIDE DISMUTASE, CATALASE, AND GLUTATHIONE PEROXIDASE IN CULTURED CELLS AND TISSUE.（请见附件）
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8楼2012-04-29 12:55:57
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wqj1988926

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
liujie2008(金币+1):谢谢参与
liujie2008(金币+1): 2011-02-16 09:13:05
dhd997(金币+2): 谢谢交流 2011-02-16 10:37:52
具体的公式我忘了，不需要做线性的，是通过一段时间酶催化底物反应后引起的紫外变化来求算酶的活力（注意酶单位的确定减少复杂程度）。具体的方法参考文献，CAT,APX,POD很多人做的
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2楼2011-02-16 08:50:20
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liujie2008

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by wqj1988926 at 2011-02-16 08:50:20:
具体的公式我忘了，不需要做线性的，是通过一段时间酶催化底物反应后引起的紫外变化来求算酶的活力（注意酶单位的确定减少复杂程度）。具体的方法参考文献，CAT,APX,POD很多人做的

谢谢了
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3楼2011-02-16 09:13:28
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
★ ★
liujie2008(金币+1): 谢谢参与
西瓜: 金币+1, 有现成的就不必浪费自己时间啦 2012-04-29 17:38:37
“ 过氧化氢酶的活力测定——紫外吸收法
一。原理：H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活力。
二。材料、仪器与试剂
        （一）、材料：小麦叶片
        （二）、仪器（仪器的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审定）
        紫外分光光度计；离心机；研钵；250ml容量瓶1个；0.5ml刻度吸管2支，2ml刻度吸管1支；10ml试管3支；恒温水浴；
        （三）、试剂（试剂的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审定后并配制）
0.2mol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1%聚乙烯吡咯烷酮）；0.1mol/L H2O2（用0.1mol/L高锰酸钾标定）。
三、实验操作：
        1.酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中，加入2～3ml 4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀将量瓶置5℃冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000rpm下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。5℃下保存备用。
        2.测定：取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表40-2顺序加入试剂。
        表40-2  紫外吸收法测定H2O2样品液配置表
管  号        S0        S1        S2
粗酶液(ml)        0.2（煮死酶液）        0.2        0.2
pH7.8磷酸(ml)        1.5        1.5        1.5
蒸馏水(ml)        1.0        1.0        1.0
        25℃预热后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活力。
五、计算
        以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（u）。
    过氧化氢酶活力(u/gFW/min)=
        式中  A240 = AS0－
           AS0—加入煮死酶液的对照管吸光值；
           AS1, AS2—样品管吸光值；
           Vt—粗酶提取液总体积（ml）；
           V1—测定用粗酶液体积（ml）；
           FW—样品鲜重（g）；
           0.1—A240每下降0.1为1个酶活单位（u）；
           t—加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。”
转自百度文库，我实在不喜欢打字。
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4楼2012-04-29 12:23:11
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凌波丽

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“直接紫外分光光度法。该方法利用H2oz在波长294 nm处有一个吸收高峰[，吸光度与lH20 含量成正比来计算。取CAT粗酶提取液1．00 mL， 加入30~mol／L的H202 2．00ⅡlL，迅速混匀，用UV一120光度计测定反应开始后4 min内对波长294 nm光线的吸光度(用“OD ’表示)的数值变化AOD2g4。以1．00 mL CAT粗酶提取液与2．00mL H20的混合液为空白对照。CAT与H202反应只在前5 min内呈线性关系， 因此要在酶加底物后的30 S内读出原始读数。”-------来自百度文库。
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5楼2012-04-29 12:24:51
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
★
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“1. 酶液制备  取1.0g植物叶片剪碎，按1∶3（W/V）加入预冷的50mmol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液进行研磨提取，用2层纱布过滤，滤液离心（4000×g）10min，上清液作酶粗提液供测定。

2. 酶活性测定  3ml反应混合液中含50mmol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液（pH7.0），0.1mmol/L EDTA-Na2，0.3mmol/L AsA，0.06mmol/L H2O2和0.1ml酶液。加入H2O2后立即在20℃下测定10～30秒内的A290变化，计算单位时间内AsA减少量及酶活性。”-----来自百度知道
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6楼2012-04-29 12:45:17
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
APX的测定：
“1. 酶液制备  取1.0g植物叶片剪碎，按1∶3（W/V）加入预冷的50mmol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液进行研磨提取，用2层纱布过滤，滤液离心（4000×g）10min，上清液作酶粗提液供测定。

2. 酶活性测定  3ml反应混合液中含50mmol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液（pH7.0），0.1mmol/L EDTA-Na2，0.3mmol/L AsA，0.06mmol/L H2O2和0.1ml酶液。加入H2O2后立即在20℃下测定10～30秒内的A290变化，计算单位时间内AsA减少量及酶活性。”-----来自百度知道
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7楼2012-04-29 12:46:05
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凌波丽

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西瓜: 回帖置顶 2012-04-29 17:39:07
更正：4楼的计算公式没有打上去，请见8楼中文附件，6楼和7楼的过氧化氢的最大吸收峰不对！不是在290nm,而是240nm，当是转帖时没有仔细看，。
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9楼2012-04-29 12:59:18
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凌波丽

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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西瓜: 金币+5, 很热心啊，原始文献都找来了~恭喜你，你现在是金虫了，点页面上方等级旁边的“升级”就可以了~~~ 2012-04-29 17:41:32
A  SPECTROPHOTOMETRIC  METHOD  FOR  MEASURING  THE BREAKDOWN  OF  HYDROGEN  PEROXIDE  BY  CATALASE-JBC(1952)，可以参考，并且此文中也说道过氧化氢的最有用的吸收峰是在240nm.
“Method
Into  each of four  cuvettes  are pipetted  2 ml. of buffered  catalase  solution;  to  one, which  serves  as control,  is  added  1 ml. of buffer.  The  slide wire  coil is  set at the  optical  density  near the  initial  value for  the  hydrogen peroxide  and  the  slit  width  is  adjusted  to  the  particular  wave-length selected.  For  routine  assays  2400 A has been found  to  be the  most useful wave-length.  The selector  switch  is  set  at  1.0.”
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liujie2008
10楼2012-04-29 13:22:26
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liujie2008

金虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
1607975楼: Originally posted by 凌波丽 at 2012-04-29 13:22:26:
A  SPECTROPHOTOMETRIC  METHOD  FOR  MEASURING  THE BREAKDOWN  OF  HYDROGEN  PEROXIDE  BY  CATALASE-JBC(1952)，可以参考，并且此文中也说道过氧化氢的最有用的吸收峰是在240nm.
“Method
Into  each of  ...

实在很是详细，多谢了
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11楼2012-05-02 09:26:50
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努力吧

金虫 (小有名气)
很不错的点子。。。。。。
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12楼2012-10-23 21:44:23
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