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基因序列的敲除 已有1人参与
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大家好，请教各位大神一个问题： 本人想纯化蛋白长晶体，但是表达出来的蛋白一直降解，发现里面有一段很长的无规卷曲区域，现在想通过基因敲除敲掉表达无规卷曲那一段的序列，不知道搞怎么操作，就大神指导，并给出具体的protocol。 谢谢！  |
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Huobol
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3楼2015-09-10 17:23:15
【答案】应助回帖
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枫叶留殇: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-09-12 08:54:55
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对于你想敲出基因中间一段，其他部位又需要表达，比较困难，因为常规基因敲除技术是将整个基因沉默的，这里我倒是有一个办法，理论上可行，实际没操作过，你如果觉得可行就做，纯粹本人想象出来的。 实验步骤： 1、将基因完整ORF拉出来（在起始密码子上游及终止密码子下游设计引物，在上下游引物两端添加相同的酶切位点，此酶切位点在整个PCR产物中必须要是唯一的，以cDNA为模板）； 2、回收PCR产物，用连接酶进行连接（不需要添加任何载体），再在无规卷曲两端设计反向引物，同样在引物两端同时添加另一种酶切位点，以连接产物为模板进行PCR，产物回收，用连接酶进行连接（不需要添加任何载体）； 3、再以第二次连接产物为模板，基因全长引物为模板PCR，产物克隆到T载体或者其他克隆载体，以该改造过的ORF构建表达载体，所表达蛋白即可去掉无规卷曲部分。 注意： 1、为了增加连接底物量，PCR产物可以直接沉淀，杂带不会影响结果； 2、已连接产物为模板进行的PCR，产物可能会有几个带，选取除引物二聚体外最小的带； 3、设计反向引物时，一定要保证不能让基因发生移码突变，这一步是最关键的，保证无规卷曲两端的氨基酸序列无误； 4、所有PCR过程必须使用高保真DNA聚合酶。 以上纯属个人意见，一个字一个字码出来的，仅供参考！ |
2楼2014-09-11 15:22:52
4楼2015-09-13 20:04:55
renzhiq
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5楼2015-09-13 21:53:44
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