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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 基因序列的敲除
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枫叶留殇

新虫 (正式写手)

[求助] 基因序列的敲除 已有1人参与

大家好，请教各位大神一个问题：
本人想纯化蛋白长晶体，但是表达出来的蛋白一直降解，发现里面有一段很长的无规卷曲区域，现在想通过基因敲除敲掉表达无规卷曲那一段的序列，不知道搞怎么操作，就大神指导，并给出具体的protocol。
谢谢！
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在冲往未来的道路上，我会全力以赴~~~
1楼 2014-09-10 15:52:14
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王平阳

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, MolEPI+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-09-11 15:26:08
枫叶留殇: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-09-12 08:54:55
对于你想敲出基因中间一段，其他部位又需要表达，比较困难，因为常规基因敲除技术是将整个基因沉默的，这里我倒是有一个办法，理论上可行，实际没操作过，你如果觉得可行就做，纯粹本人想象出来的。

实验步骤：
1、将基因完整ORF拉出来（在起始密码子上游及终止密码子下游设计引物，在上下游引物两端添加相同的酶切位点，此酶切位点在整个PCR产物中必须要是唯一的，以cDNA为模板）；
2、回收PCR产物，用连接酶进行连接（不需要添加任何载体），再在无规卷曲两端设计反向引物，同样在引物两端同时添加另一种酶切位点，以连接产物为模板进行PCR，产物回收，用连接酶进行连接（不需要添加任何载体）；
3、再以第二次连接产物为模板，基因全长引物为模板PCR，产物克隆到T载体或者其他克隆载体，以该改造过的ORF构建表达载体，所表达蛋白即可去掉无规卷曲部分。

注意：
1、为了增加连接底物量，PCR产物可以直接沉淀，杂带不会影响结果；
2、已连接产物为模板进行的PCR，产物可能会有几个带，选取除引物二聚体外最小的带；
3、设计反向引物时，一定要保证不能让基因发生移码突变，这一步是最关键的，保证无规卷曲两端的氨基酸序列无误；
4、所有PCR过程必须使用高保真DNA聚合酶。

以上纯属个人意见，一个字一个字码出来的，仅供参考！
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没有做不到，只有想不到！
2楼2014-09-11 15:22:52
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普通回帖

Huobol

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 王平阳 at 2014-09-11 15:22:52
对于你想敲出基因中间一段，其他部位又需要表达，比较困难，因为常规基因敲除技术是将整个基因沉默的，这里我倒是有一个办法，理论上可行，实际没操作过，你如果觉得可行就做，纯粹本人想象出来的。

实验步骤：
...

推荐几个你们用的高保真聚合酶，哪个公司的什么牌子，好用吗？谢谢！！
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让羽毛再飞一会儿
3楼2015-09-10 17:23:15
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枫叶留殇

新虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 王平阳 at 2014-09-11 15:22:52
对于你想敲出基因中间一段，其他部位又需要表达，比较困难，因为常规基因敲除技术是将整个基因沉默的，这里我倒是有一个办法，理论上可行，实际没操作过，你如果觉得可行就做，纯粹本人想象出来的。

实验步骤：
...

我后来就是用这种方法做的，敲除是成功了，但是蛋白质还是没做出来
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在冲往未来的道路上，我会全力以赴~~~
4楼2015-09-13 20:04:55
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renzhiq

木虫 (小有名气)
首先，你得告诉我你纯化蛋白是从野生菌中，还是重组菌。重组菌的话就太简单了，野生菌就要费事了……

发自小木虫Android客户端
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5楼2015-09-13 21:53:44
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