| 查看: 1081 | 回复: 4 | ||
| 本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
[求助]
基因序列的敲除 已有1人参与
|
||
|
大家好，请教各位大神一个问题： 本人想纯化蛋白长晶体，但是表达出来的蛋白一直降解，发现里面有一段很长的无规卷曲区域，现在想通过基因敲除敲掉表达无规卷曲那一段的序列，不知道搞怎么操作，就大神指导，并给出具体的protocol。 谢谢！  |
回复此楼» 猜你喜欢
含氟糖皮质激素的外用抗炎利器醋酸氟轻松
已经有0人回复
-
阿莫奈韦（Amenamevir）：解旋酶-引物酶靶向分子的结构特征与合成路径全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有80人回复
-
利瑞鲁单抗：靶向KIR的NK细胞检查点工具抗体，结构基础与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 怎样在NCBI上查找基因的cDNA序列
已经有14人回复
- 基因序列优化办法
已经有9人回复
- 求pkD4卡那霉素抗性基因kan的基因序列？
已经有8人回复
- 怎样分析基因组序列？
已经有7人回复
- 如何用NCBI查找一段基因序列的启动子？
已经有11人回复
- 不知道一株菌的全基因组序列能否做某个基因的过表达
已经有3人回复
- PCR引物必须与目的基因片段的一小段序列互补吗？急！！！
已经有9人回复
- 怎样知道病毒的基因序列，例如乙肝病毒，或者大肠杆菌病毒
已经有4人回复
- 已知一个基因的DNA序列，怎么得到它的cDNA序列，我想做RT-PCR
已经有6人回复
- 已知基因的氨基酸序列，怎么在NCBI上找到核苷酸序列啊~~
已经有9人回复
- NCBI中的蛋白序列与基因序列不对应
已经有3人回复
- 如何查找一段基因序列的启动子？
已经有3人回复
- 如何确定所测DNA序列是哪个物种的?
已经有6人回复
- 求助E.coli BL系列的全基因序列！
已经有14人回复
- 如何得到已知蛋白序列的对应的基因序列
已经有8人回复
- 【求助/交流】如何用NCBI的BLAST来找到一个基因的保守序列?
已经有11人回复
- 【求助/交流】基因敲除后的回补实验，如何确定基因的上游和下游的调节区？
已经有4人回复
- 【求助/交流】现在有哪些植物的全基因组序列已经测完了？
已经有5人回复
renzhiq
木虫 (小有名气)
- 应助: 56 (初中生)
- 金币: 2106.1
- 红花: 9
- 帖子: 298
- 在线: 53.3小时
- 虫号: 1949303
- 注册: 2012-08-21
- 性别: GG
- 专业: 微生物学
5楼2015-09-13 21:53:44
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, MolEPI+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-09-11 15:26:08
枫叶留殇: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-09-12 08:54:55
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, MolEPI+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-09-11 15:26:08
枫叶留殇: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-09-12 08:54:55
|
对于你想敲出基因中间一段，其他部位又需要表达，比较困难，因为常规基因敲除技术是将整个基因沉默的，这里我倒是有一个办法，理论上可行，实际没操作过，你如果觉得可行就做，纯粹本人想象出来的。 实验步骤： 1、将基因完整ORF拉出来（在起始密码子上游及终止密码子下游设计引物，在上下游引物两端添加相同的酶切位点，此酶切位点在整个PCR产物中必须要是唯一的，以cDNA为模板）； 2、回收PCR产物，用连接酶进行连接（不需要添加任何载体），再在无规卷曲两端设计反向引物，同样在引物两端同时添加另一种酶切位点，以连接产物为模板进行PCR，产物回收，用连接酶进行连接（不需要添加任何载体）； 3、再以第二次连接产物为模板，基因全长引物为模板PCR，产物克隆到T载体或者其他克隆载体，以该改造过的ORF构建表达载体，所表达蛋白即可去掉无规卷曲部分。 注意： 1、为了增加连接底物量，PCR产物可以直接沉淀，杂带不会影响结果； 2、已连接产物为模板进行的PCR，产物可能会有几个带，选取除引物二聚体外最小的带； 3、设计反向引物时，一定要保证不能让基因发生移码突变，这一步是最关键的，保证无规卷曲两端的氨基酸序列无误； 4、所有PCR过程必须使用高保真DNA聚合酶。 以上纯属个人意见，一个字一个字码出来的，仅供参考！ |
2楼2014-09-11 15:22:52
Huobol
至尊木虫 (著名写手)
- 应助: 15 (小学生)
- 金币: 14473.1
- 散金: 70
- 红花: 7
- 帖子: 1274
- 在线: 162.9小时
- 虫号: 1214385
- 注册: 2011-02-26
- 性别: GG
- 专业: 基因表达调控与表观遗传学
3楼2015-09-10 17:23:15
4楼2015-09-13 20:04:55
