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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » SDS-PAGE 遇到问题
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angelagirls

金虫 (正式写手)

Talent Acquisition

[求助] SDS-PAGE 遇到问题 已有3人参与

跑了好多天的电泳 让人要疯了的赶脚
我的marker是1.2-4.5的 分离胶15% 浓缩胶3%   蛋白浓度1mg/mL  
跑电泳时  溴酚蓝颜色特别浅 基本上很难看到 mark只能跑出来三条  最后脱色完 样品基本上木有条带 雁过无痕啊 甚是伤心
求指教
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1楼 2014-09-05 21:31:53
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robertno

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
有可能是marker失效了，楼主试试重新买一个marker，Takara的不错。溴酚蓝的话可以多加一些，没什么影响。
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2楼2014-09-05 21:54:08
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angelagirls

金虫 (正式写手)

Talent Acquisition
引用回帖:
2楼: Originally posted by robertno at 2014-09-05 21:54:08
有可能是marker失效了，楼主试试重新买一个marker，Takara的不错。溴酚蓝的话可以多加一些，没什么影响。

marker是新买的……溴酚蓝一般是加多少

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3楼2014-09-06 12:16:52
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biolab910

新虫 (初入文坛)
你这是小分子，是不是要用固定液先固定下
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4楼2014-09-07 18:52:58
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欧阳-90

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
angelagirls: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-09-17 09:20:47
你的蛋白太小了，常规的PAGE胶不能跑出来的。需要Tricine电泳
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5楼2014-09-16 16:08:36
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angelagirls

金虫 (正式写手)

Talent Acquisition
引用回帖:
5楼: Originally posted by 欧阳-90 at 2014-09-16 16:08:36
你的蛋白太小了，常规的PAGE胶不能跑出来的。需要Tricine电泳

嗯嗯  现在打算做这个呢  请问有没有方案啊

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6楼2014-09-16 19:23:57
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欧阳-90

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by angelagirls at 2014-09-16 19:23:57
嗯嗯  现在打算做这个呢  请问有没有方案啊
...

这个电泳方法网上都有大神贴出了标准程序，你看一下就知道了。小木虫和丁香园里应该都有的，很简单
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7楼2014-09-17 09:31:56
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欧阳-90

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 欧阳-90 at 2014-09-16 16:08:36
你的蛋白太小了，常规的PAGE胶不能跑出来的。需要Tricine电泳

一：
Tricine-SDS-PAGE是一种适用分离鉴定小分子量蛋白的电泳方案。常见有两种：一是由16%分离胶，10%间隙胶，4%浓缩胶；二是16%分离胶，4%浓缩胶。
二：溶液配制
  阳极缓冲液：0.2M Tris-HCl.  pH8.9(准确调)
  阴极缓冲液：0.1M Tris-HCl，0.1M Tricine, 0.1%（m/v）SDS，pH8.25（不需要调很多）
  凝胶缓冲液：3M Tris-HCl, 0.3%(m/v)SDS,pH8.45（pH需要准确调）
30%丙烯酰胺：29.0g丙烯酰胺，1.0g甲叉双丙烯酰胺，定容到100ml。
三：配胶配方
   
        16%分离胶        10%间隙胶        4%浓缩胶
凝胶缓冲液        2.0ml        1.34ml        0.75ml
30%丙烯酰胺        4.26ml        1.67ml        0.42ml
尿素        2.16g        —        —
水        1.5ml        2ml        1.9ml
10%APS        100 μl        30 μl        50 μl
TEMED        10 μl        3 μl        5 μl

胶层高度比例：3cm—2cm—2cm
四：配置事项：
A: 分离胶和间隙胶同时加入胶板：分离胶加入3厘米，然后加入间隙胶2厘米 。最后加入20%乙醇液封；
B: 胶凝后，加入浓缩胶；
C: 样品的处理：对样品的pH要求比较严格，确保样品的PH在8.45左右；
D: 样品的上样量不能过大；
E：电泳槽内槽为阴极，外液阳极。注意不要漏液，是内外液相通。
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8楼2014-09-17 09:36:22
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欧阳-90

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
angelagirls: 金币+3, ★★★很有帮助 2014-09-19 09:02:12
一：
Tricine-SDS-PAGE是一种适用分离鉴定小分子量蛋白的电泳方案。常见有两种：一是由16%分离胶，10%间隙胶，4%浓缩胶；二是16%分离胶，4%浓缩胶。
二：溶液配制
  阳极缓冲液：0.2M Tris-HCl.  pH8.9(准确调)
  阴极缓冲液：0.1M Tris-HCl，0.1M Tricine, 0.1%（m/v）SDS，pH8.25（不需要调很多）
  凝胶缓冲液：3M Tris-HCl, 0.3%(m/v)SDS,pH8.45（pH需要准确调）
30%丙烯酰胺：29.0g丙烯酰胺，1.0g甲叉双丙烯酰胺，定容到100ml。
三：配胶配方
   
        16%分离胶        10%间隙胶        4%浓缩胶
凝胶缓冲液        2.0ml        1.34ml        0.75ml
30%丙烯酰胺        4.26ml        1.67ml        0.42ml
尿素        2.16g        —        —
水        1.5ml        2ml        1.9ml
10%APS        100 μl        30 μl        50 μl
TEMED        10 μl        3 μl        5 μl

胶层高度比例：3cm—2cm—2cm
四：配置事项：
A: 分离胶和间隙胶同时加入胶板：分离胶加入3厘米，然后加入间隙胶2厘米 。最后加入20%乙醇液封；
B: 胶凝后，加入浓缩胶；
C: 样品的处理：对样品的pH要求比较严格，确保样品的PH在8.45左右；
D: 样品的上样量不能过大；
E：电泳槽内槽为阴极，外液阳极。注意不要漏液，是内外液相通。
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9楼2014-09-17 09:38:00
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

既然分子量这么小就用20%的胶，压缩胶5%。
溴酚蓝淡只能说明上样量太少。
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10楼2014-09-17 09:38:51
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