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蓝默儿金虫 (小有名气)
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夹心ELISA方法的建立及酶标单抗 已有6人参与
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本人一直在建定量夹心ELISA方法：双抗体夹心检抗原，但是阴性、空白值很高。阳性OD=1.3,阴性=0.46，先头觉得是封闭液问题，尝试过几种封闭液：脱脂乳，BSA,明胶，马血清。但都没有明显改变。再想是不是本人标记单抗出现问题了， 酶标单抗是用改良的过碘酸钠法将HRP标记到单抗上，我再想是不是酶标单抗溶液中有未结合的游离HRP，在建夹心ELISA方法的过程中，游离的HRP结合到板子上，引起非特异性结合。请做过的前辈给予指点，谢谢 怎样去除游离的HRP，我的酶标抗体有的是用50%的甘油保存的，有的是50微升分装保存的。 |
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①取5mg HRP溶于0.5ml双馏水中，加入新配制的0.06Mol/L NaIO4水溶液(10ml双馏水＋128mg NaIO4) 0.5ml，混匀，置4℃30min。 ② 取出后加入0.16Mol/L乙二醇水溶液0.5ml，室温放置30min。 ③ 加入含5-10mg纯化抗体的水溶液1ml，混匀，并装入透析袋，对0.05Mol/L pH 9.5碳 酸盐缓冲液缓缓搅拌透析6h(或过夜)，使之结合。 ④加入NaBH4溶液0.2ml，混匀，置4℃2h。 ⑤在以上溶液中缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混匀，4℃ 10000rpm 离心15min，去上清，沉淀以少许0.02Mol/L pH7.4 PBS液溶解，装入透析袋，以同样液体在4℃透析除盐过夜。 ⑥次日取出离心，以除去不溶物，即得酶－抗体(HRP－IgG)结合物，以0.02Mol/L pH 7.4 PBS液加至2.5ml，加等体积甘油于-20℃冻存。 |
5楼2014-11-19 09:32:53
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谢谢露珠！我已经标记好了，步骤稍微有点不一样，不过也都差不多。 我用饱和硫酸铵等体积沉淀纯化了两次，你纯化一次可能还有游离的HRP吧。我把第一次纯化的上清也拿来做滴定了，有轻微的显色，OD最大不到0.3，酶标抗体效价大概1：2000。 另外我想问问楼主， （1）你的饱和硫酸铵是怎么配的？我是78mg加到100ml蒸馏水里，100度加热溶解，然后趁热加氨水调pH至7.0，但我感觉趁热调pH 不大妥当，是不是应该冷却了晶体析出后调呢？不知道你调pH了没有？ （2）你最后的50%甘油是终浓度吗？我加了等体积40%甘油，终浓度也就是20%，昨天放在-25的，今天一看怎么好像冻住了！  不是说酶标抗体不能冻存吗？也不知道我的酶标抗体还能用不！你的冻住了没有？ |
6楼2014-11-19 10:24:39
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