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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 抗体/Elisa » 夹心ELISA方法的建立及酶标单抗
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蓝默儿

金虫 (小有名气)

[求助] 夹心ELISA方法的建立及酶标单抗 已有6人参与

本人一直在建定量夹心ELISA方法：双抗体夹心检抗原，但是阴性、空白值很高。阳性OD=1.3,阴性=0.46，先头觉得是封闭液问题，尝试过几种封闭液：脱脂乳，BSA,明胶，马血清。但都没有明显改变。再想是不是本人标记单抗出现问题了，
    酶标单抗是用改良的过碘酸钠法将HRP标记到单抗上，我再想是不是酶标单抗溶液中有未结合的游离HRP，在建夹心ELISA方法的过程中，游离的HRP结合到板子上，引起非特异性结合。请做过的前辈给予指点，谢谢
    怎样去除游离的HRP，我的酶标抗体有的是用50%的甘油保存的，有的是50微升分装保存的。
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微笑，自信，加油
1楼 2014-08-12 15:18:16
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蓝默儿

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 可儿不苦 at 2014-09-09 15:33:36
楼主，你的标记步骤可否告知？ 我接下来的实验可能要用HRP标记单抗

①取5mg HRP溶于0.5ml双馏水中，加入新配制的0.06Mol/L NaIO4水溶液(10ml双馏水＋128mg NaIO4) 0.5ml，混匀，置4℃30min。
② 取出后加入0.16Mol/L乙二醇水溶液0.5ml，室温放置30min。
③ 加入含5-10mg纯化抗体的水溶液1ml，混匀，并装入透析袋，对0.05Mol/L pH 9.5碳    酸盐缓冲液缓缓搅拌透析6h(或过夜)，使之结合。
④加入NaBH4溶液0.2ml，混匀，置4℃2h。
⑤在以上溶液中缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混匀，4℃ 10000rpm 离心15min，去上清，沉淀以少许0.02Mol/L pH7.4 PBS液溶解，装入透析袋，以同样液体在4℃透析除盐过夜。
⑥次日取出离心，以除去不溶物，即得酶－抗体(HRP－IgG)结合物，以0.02Mol/L pH 7.4 PBS液加至2.5ml，加等体积甘油于-20℃冻存。
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微笑，自信，加油
5楼2014-11-19 09:32:53
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可儿不苦

金虫 (著名写手)
楼主，你的标记步骤可否告知？ 我接下来的实验可能要用HRP标记单抗
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幸福那一个美梦，是二人同行才有。
2楼2014-09-09 15:33:36
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ahchljctw

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

楼主，我也做双抗体夹心检测抗原，阳性OD差异性太大了，不稳定，同一个抗原，多次重复的检测结果大于10%，还有标准品的OD差异也大，但是R方很好0.99 .求教什么原因
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Stayhungry,stayfoolish
3楼2014-10-17 00:20:02
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蓝默儿

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ahchljctw at 2014-10-17 00:20:02
楼主，我也做双抗体夹心检测抗原，阳性OD差异性太大了，不稳定，同一个抗原，多次重复的检测结果大于10%，还有标准品的OD差异也大，但是R方很好0.99 .求教什么原因

你做的比我快，我刚出来标准曲线。不稳定的话，封闭液中加1%蔗糖你再试试，起到保护包被蛋白的作用。
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微笑，自信，加油
4楼2014-11-19 09:28:38
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