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蓝默儿金虫 (小有名气)
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[求助]
夹心ELISA方法的建立及酶标单抗 已有6人参与
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本人一直在建定量夹心ELISA方法：双抗体夹心检抗原，但是阴性、空白值很高。阳性OD=1.3,阴性=0.46，先头觉得是封闭液问题，尝试过几种封闭液：脱脂乳，BSA,明胶，马血清。但都没有明显改变。再想是不是本人标记单抗出现问题了， 酶标单抗是用改良的过碘酸钠法将HRP标记到单抗上，我再想是不是酶标单抗溶液中有未结合的游离HRP，在建夹心ELISA方法的过程中，游离的HRP结合到板子上，引起非特异性结合。请做过的前辈给予指点，谢谢 怎样去除游离的HRP，我的酶标抗体有的是用50%的甘油保存的，有的是50微升分装保存的。 |
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3楼2014-10-17 00:20:02
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2楼2014-09-09 15:33:36
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4楼2014-11-19 09:28:38
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①取5mg HRP溶于0.5ml双馏水中，加入新配制的0.06Mol/L NaIO4水溶液(10ml双馏水＋128mg NaIO4) 0.5ml，混匀，置4℃30min。 ② 取出后加入0.16Mol/L乙二醇水溶液0.5ml，室温放置30min。 ③ 加入含5-10mg纯化抗体的水溶液1ml，混匀，并装入透析袋，对0.05Mol/L pH 9.5碳 酸盐缓冲液缓缓搅拌透析6h(或过夜)，使之结合。 ④加入NaBH4溶液0.2ml，混匀，置4℃2h。 ⑤在以上溶液中缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混匀，4℃ 10000rpm 离心15min，去上清，沉淀以少许0.02Mol/L pH7.4 PBS液溶解，装入透析袋，以同样液体在4℃透析除盐过夜。 ⑥次日取出离心，以除去不溶物，即得酶－抗体(HRP－IgG)结合物，以0.02Mol/L pH 7.4 PBS液加至2.5ml，加等体积甘油于-20℃冻存。 |
5楼2014-11-19 09:32:53