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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 动物组织研磨和裂解问题
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仲尼

新虫 (小有名气)

[求助] 动物组织研磨和裂解问题 已有3人参与

本人近期欲做western blot，样品是动物胃肠道（四个胃和大小肠）、肾脏、肮脏，研究对象是细胞膜上的一种通道蛋白。由于是第一次做western，有如下问题，希望热心的虫友帮忙，
①我的方法是：先将组织剪碎，并加入适量RIPA裂解液，然后用手持式组织研磨器研磨（实验室没有玻璃匀浆器）。在组织研磨过程中发现，大、小肠黏膜很容易研磨；但是，瘤胃壁、肾脏和肝脏等，用上面方法的就不容易研磨，总是剩余一些组织块，不知道还有没有其他好的方法
②做过类似的试验的小伙伴们，想问下哪个公司的RIPA裂解液（裂解膜上的蛋白）好些；还有就是用不用加入蛋白酶抑制剂，如PMSF
谢谢各位了
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1楼 2014-08-10 09:26:43
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

ssssllllnnnn

至尊木虫 (知名作家)

Translator and Proofreader

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
仲尼(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-08-10 10:26:40
仲尼: 金币+1, ★★★很有帮助 2014-08-15 11:38:23
1、要达到好的匀浆效果，只有用电动式匀浆器。其实肝脏、肾脏应该更容易匀浆，这些组织比较“脆”，而胃肠道则含有大量平滑肌，相对较难些。如果你的蛋白只在胃肠粘膜上皮表达，则可以考虑将胃肠粘膜刮下来。
2、RIPA buffer不需要买，自己配置就可以了，成分简单（网上随便一搜就可以找到配方）。另外尽可能加入蛋白酶抑制剂, 最方便的是Roche公司的cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets （http://labs.mmg.pitt.edu/gjoerup/protease%20inhibitor.pdf）。如果你的目标蛋白是一种磷酸化蛋白，而且与你的研究相关联，则尚需加入磷酸酶抑制剂。
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3楼2014-08-10 09:40:31
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普通回帖

for5

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
仲尼(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-10 10:26:26
1.液氮研磨
2.要加，如果是磷酸化还要加磷酸化抑制剂，一般有cocktail
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操蛋的XX
2楼2014-08-10 09:30:51
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仲尼

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by for5 at 2014-08-10 09:30:51
1.液氮研磨
2.要加，如果是磷酸化还要加磷酸化抑制剂，一般有cocktail

十分感谢！另外，我要检测的是目的蛋白的总量（可能包括磷酸化的和未磷酸化的），这样的话是不是可以不加磷酸化酶抑制剂呢？
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4楼2014-08-10 10:02:57
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仲尼

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ssssllllnnnn at 2014-08-10 09:40:31
1、要达到好的匀浆效果，只有用电动式匀浆器。其实肝脏、肾脏应该更容易匀浆，这些组织比较“脆”，而胃肠道则含有大量平滑肌，相对较难些。如果你的蛋白只在胃肠粘膜上皮表达，则可以考虑将胃肠粘膜刮下来。
2、R ...

好的，十分感谢！
那个蛋白酶抑制剂还是挺贵的，如果没有条件可以只加PMSF吗？
我要检测的是目标蛋白的总量（可能有磷酸化的），这样的话是不是可以不加磷酸酶抑制剂呢
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5楼2014-08-10 10:18:14
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ssssllllnnnn

至尊木虫 (知名作家)

Translator and Proofreader
引用回帖:
5楼: Originally posted by 仲尼 at 2014-08-09 21:18:14
好的，十分感谢！
那个蛋白酶抑制剂还是挺贵的，如果没有条件可以只加PMSF吗？
我要检测的是目标蛋白的总量（可能有磷酸化的），这样的话是不是可以不加磷酸酶抑制剂呢...

可以呀。如果你不太关心磷酸化的问题可以不加。
对了，做蛋白的时候，只要有可能尽量在冰上做，否则降解是个问题。
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6楼2014-08-10 10:20:11
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仲尼

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by ssssllllnnnn at 2014-08-10 10:20:11
可以呀。如果你不太关心磷酸化的问题可以不加。
对了，做蛋白的时候，只要有可能尽量在冰上做，否则降解是个问题。...

好的，谢谢
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7楼2014-08-10 10:38:08
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hululu0725

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-10-04 22:19:05
我们用筛网研磨，效果还不错，另外RIPA，碧云天公司的还不错，裂解强度有强中弱，适合磷酸化还是非磷酸化的WB，说明书上都有，很便宜，小几百，还有PMSF最好加的
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8楼2014-08-12 15:18:26
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仲尼

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by hululu0725 at 2014-08-12 15:18:26
我们用筛网研磨，效果还不错，另外RIPA，碧云天公司的还不错，裂解强度有强中弱，适合磷酸化还是非磷酸化的WB，说明书上都有，很便宜，小几百，还有PMSF最好加的

筛网如何研磨呢？把组织放在筛子上，然后加液氮研磨吗？
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9楼2014-08-13 08:44:34
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hululu0725

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by 仲尼 at 2014-08-13 08:44:34
筛网如何研磨呢？把组织放在筛子上，然后加液氮研磨吗？...

可以加液氮也可以不用，我们用注射器柄研磨，筛网漏下的就是细胞悬液，比较好裂解

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10楼2014-08-13 09:41:32
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