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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » Red 同源重组测序突变
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summermio

新虫 (初入文坛)

[求助] Red 同源重组测序突变 已有2人参与

最近在做Red同源重组， 需要把一段基因插入大肠杆菌基因组的几个不同位置。
用菌落PCR总共筛选到10几个阳性菌落，送去测序后却发现在上游同源臂范围内总有碱基缺失或者多余的碱基插入。 这样造成的移位导致无法进行后续试验。
想问下大家Red重组的突变率有这么高吗？或者有没有什么办法减少这种突变的发生
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1楼 2014-08-05 17:03:54
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bolysu

禁虫 (著名写手)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽
2楼2014-08-06 11:51:50
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summermio

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by bolysu at 2014-08-06 11:51:50
重组怎么会突变？是你PCR时突变的吧？用高保真的酶吧，像pfu

试过用phusion， 但是怎么都p不出条带，只好换成phire. 我觉得跟酶的关系不太大，因为除了上游同源臂附近， 其他地方基本不出现突变的呀
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3楼2014-08-06 17:02:33
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wszl666

银虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
那就先测序你的PCR啊 看看是不是PCR的原因
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基因敲除
4楼2014-08-07 11:02:22
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summermio

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by wszl666 at 2014-08-07 11:02:22
那就先测序你的PCR啊 看看是不是PCR的原因

测序过了 也不是。 而且每次拿到的重组子突变的地方都不一样啊。用的是同样的pcr产物。所以产物应该没问题， 真的好奇怪
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5楼2014-08-11 16:36:40
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