应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】反敲除
151/1返回列表
查看: 1894  |  回复: 14
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

wwdxx2004

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】反敲除

请问FRT位点都是一样的吗？我对我敲除后的菌进行测序发现FRT位点处有一个突变 会不会对反敲除有影响呐 谢谢
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2010-12-16 20:27:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

susizheng

木虫 (著名写手)
会不会是测序的误差，先反敲除着看看。
赞一下 回复此楼
2楼2010-12-16 21:25:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

scelab

荣誉版主 (文坛精英)
引用回帖:
Originally posted by wwdxx2004 at 2010-12-16 20:27:46:
请问FRT位点都是一样的吗？我对我敲除后的菌进行测序发现FRT位点处有一个突变 会不会对反敲除有影响呐 谢谢

什么叫 反敲除
回复此楼
3楼2010-12-16 21:44:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

susizheng

木虫 (著名写手)
★
wwdxx2004(金币+1): 2010-12-17 20:54:13
dhd997(金币+1):good 2010-12-18 13:53:13
引用回帖:
Originally posted by scelab at 2010-12-16 21:44:29:

什么叫 反敲除

反敲除，就是转入抗性片段敲除基因后，转入pCP20表达FLP重组酶，利用抗性片段两端的FRT序列将抗性标记删除。
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2010-12-17 09:19:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

scelab

荣誉版主 (文坛精英)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2010-12-17 09:19:24:

反敲除，就是转入抗性片段敲除基因后，转入pCP20表达FLP重组酶，利用抗性片段两端的FRT序列将抗性标记删除。

对于pCP20和FLP重组酶，没概念
有相关资料介绍下么
赞一下 回复此楼
5楼2010-12-17 09:23:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

susizheng

木虫 (著名写手)
★ ★
scelab(金币+2):谢谢噢~~~你们看的都是nature级的文章，很强大~~~ 2010-12-17 09:53:33
wwdxx2004(金币+1): 2010-12-17 20:54:21
引用回帖:
Originally posted by scelab at 2010-12-17 09:23:56:

对于pCP20和FLP重组酶，没概念
有相关资料介绍下么

Sharan, S. K., L. C. Thomason, et al. (2009). "☆Recombineering: a homologous recombination-based method of genetic engineering." NATURE PROTOCOLS.
Kuhlman, T. E. and E. C. Cox (2010). "☆Site-specific chromosomal integration of large synthetic constructs." Nucleic Acids Res 38(6): e92.
比较经典的是介绍pKD46这个敲除系统的，暂时没找出来。
赞一下(1人) 回复此楼
6楼2010-12-17 09:36:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

最爱花诗雨

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
wwdxx2004(金币+1): 2010-12-17 20:57:23
scelab(金币+3):谢谢交流！:tiger06: 2010-12-17 23:15:56
1楼说的有可能，测序出来结果误差的可能性还是很大的，因为对于Flp/FRT系统，具有良好的稳定性，你的“反敲除”只是一个pCP20的转化热击表达消除抗性基因片段的过程，不麻烦的，如果真的是FRT位点的一个突变，即使抗性基因消除以后，FRT还是会留在序列上，对后期的发酵有没有影响还是不好说的。呵呵~~希望是测序的问题
赞一下(1人) 回复此楼
7楼2010-12-17 10:06:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wwdxx2004

金虫 (正式写手)
现在的问题是PCP20丢不了，反敲也没有成功，看文献报道反敲成功几率挺大的，但是到目前为止，没有结果，也不知道那块有问题
赞一下 回复此楼
8楼2010-12-17 20:59:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ben1147

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2010-12-17 09:36:42:

Sharan, S. K., L. C. Thomason, et al. (2009). "☆Recombineering: a homologous recombination-based method of genetic engineering." NATURE PROTOCOLS.
Kuhlman, T. E. and E. C. Cox (2010). ...

当年本科毕设用pKD46的时候稀里糊涂就用了，压根什么都不明白。现在想想那时候真是无知者无畏，哈哈
赞一下 回复此楼
9楼2010-12-17 22:54:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

最爱花诗雨

金虫 (正式写手)
wwdxx2004(金币+1): 2010-12-18 13:17:28
wwdxx2004(金币+1): 2010-12-19 11:08:12
引用回帖:
Originally posted by wwdxx2004 at 2010-12-17 20:59:13:
现在的问题是PCP20丢不了，反敲也没有成功，看文献报道反敲成功几率挺大的，但是到目前为止，没有结果，也不知道那块有问题

pCP20在42摄氏度就可以消失的，如果一直去不掉的抗性片段的话，重新做一次重组敲除好了，不麻烦的，这样能排除FRT位点突变的可能了。为什么一定要测序的？不是很浪费吗？电泳跑胶条带没问题就可以了
赞一下 回复此楼
10楼2010-12-18 12:33:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wwdxx2004

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 最爱花诗雨 at 2010-12-18 12:33:00:

pCP20在42摄氏度就可以消失的，如果一直去不掉的抗性片段的话，重新做一次重组敲除好了，不麻烦的，这样能排除FRT位点突变的可能了。为什么一定要测序的？不是很浪费吗？电泳跑胶条带没问题就可以了

重新做一次重组敲除，还是比较麻烦的 ，我们实验室的做了好久都没有敲掉，我是比较幸运，敲除了，但是一直被反敲麻烦着，其实这样还不如重做一次敲除呢，不知道金虫敲除有什么高招？
赞一下 回复此楼
11楼2010-12-18 13:20:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wwdxx2004

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2010-12-16 21:25:22:
会不会是测序的误差，先反敲除着看看。

做了好多次反敲了，都不行，不知道是不是PCP20质粒不行，每次提的PCP20跑胶条带都很弱，转化倒是没什么问题，就是完成不了重组，不知道木虫有什么更好的建议，谢谢！
赞一下 回复此楼
12楼2010-12-19 11:12:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

最爱花诗雨

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by wwdxx2004 at 2010-12-18 13:20:50:

重新做一次重组敲除，还是比较麻烦的 ，我们实验室的做了好久都没有敲掉，我是比较幸运，敲除了，但是一直被反敲麻烦着，其实这样还不如重做一次敲除呢，不知道金虫敲除有什么高招？

敲除，对于大肠杆菌，Red同源重组是比较好用的方法了，通常情况下，会出现在重组环节，不过，你为什么一定要反敲除呢？留着那个抗性基因影响很大吗？
赞一下(1人) 回复此楼
13楼2010-12-20 09:16:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

最爱花诗雨

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by wwdxx2004 at 2010-12-19 11:12:39:

做了好多次反敲了，都不行，不知道是不是PCP20质粒不行，每次提的PCP20跑胶条带都很弱，转化倒是没什么问题，就是完成不了重组，不知道木虫有什么更好的建议，谢谢！

pCP20质粒，本来浓度就不会很高的，但不会影响转化效率。
赞一下 回复此楼
14楼2010-12-20 09:17:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xiuluokemo

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
989437楼: Originally posted by wwdxx2004 at 2010-12-16 20:27:46
请问FRT位点都是一样的吗？我对我敲除后的菌进行测序发现FRT位点处有一个突变 会不会对反敲除有影响呐 谢谢

可以跟我讲讲你做red敲除的经验吗？最近做这个，涂板发现板上什么东西都没长！
赞一下 回复此楼
15楼2012-08-21 10:48:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 wwdxx2004 的主题更新
151/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 时间戳变了，能看出什么问题？ +17 基诺咪客 2026-08-17 22/1100 2026-08-20 16:47 by 基诺咪客
[基金申请] 时间戳又变了 +11 wuchongjun 2026-08-20 14/700 2026-08-20 16:26 by 虫友是什么虫
[基金申请] 今天系统多次维护，明天很可能放榜！ +9 zju2000 2026-08-16 10/500 2026-08-20 15:56 by Leogzhya
[基金申请] 放榜前的不淡定 40+3 snowwithsea 2026-08-19 12/600 2026-08-20 15:56 by lfy8008
[基金申请] 言之凿凿，明天官网会通知放榜？ +14 医学老男孩 2026-08-20 16/800 2026-08-20 15:47 by LNP@mRNA
[基金申请] 重要消息，中午系统在维护 +11 yuleib84 2026-08-18 12/600 2026-08-20 11:09 by xskun
[基金申请] 只有每年这种时候来逛逛小木虫 +21 yaoyewhu2008 2026-08-20 21/1050 2026-08-20 10:37 by Vivilian
[基金申请] 今天基金会出结果吗？20260819 +14 kkkl_v 2026-08-19 15/750 2026-08-20 08:21 by sunzitan
[教师之家] 为什么余额宝的年化利率越来越低？主要原因有哪些？ +5 瞬息宇宙 2026-08-15 5/250 2026-08-19 20:23 by super2002521
[基金申请] 今天放榜没戏了吧 +4 yuleib84 2026-08-19 5/250 2026-08-19 19:52 by hhs666
[基金申请] filecode=后面第一个是大写字母 +10 wangze12014 2026-08-14 12/600 2026-08-19 16:56 by 苦难博士
[基金申请] 2027广东省杰青 +4 奶牛小黑 2026-08-15 10/500 2026-08-19 11:02 by wanfengnew
[基金申请] 朋友圈看到的 +6 wangzilk 2026-08-18 8/400 2026-08-19 10:55 by Haru815
[基金申请] 什么时候开奖？ +6 CrisMessi 2026-08-18 6/300 2026-08-19 08:06 by Equinoxhua
[基金申请] 明天放榜？ +5 Shxjjxjkx 2026-08-18 5/250 2026-08-18 18:14 by -大大大大大-
[论文投稿] 投稿咨询 +4 wwm09 2026-08-17 6/300 2026-08-18 15:36 by wwm09
[基金申请] 今天维护系统维护 祝所有人 高中 +8 gjjjzhong 2026-08-18 9/450 2026-08-18 13:01 by 家与远方
[基金申请] 93BebMhtakh前后11位开头都是大写 +4 且听虎啸 2026-08-17 5/250 2026-08-18 00:49 by 蔡棒棒菂
[基金申请] 感觉是下周放榜了 +6 angus9576 2026-08-17 11/550 2026-08-17 23:57 by angus9576
[基金申请] 各位道友，我要去昆明玩几天，回来见。 +7 Tide man 2026-08-14 8/400 2026-08-15 01:11 by arzu_hma
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭