[交流] 【求助/交流】反敲除

Originally posted by wwdxx2004 at 2010-12-16 20:27:46:
请问FRT位点都是一样的吗？我对我敲除后的菌进行测序发现FRT位点处有一个突变 会不会对反敲除有影响呐 谢谢

Originally posted by scelab at 2010-12-16 21:44:29:

什么叫 反敲除

Originally posted by susizheng at 2010-12-17 09:19:24:

反敲除，就是转入抗性片段敲除基因后，转入pCP20表达FLP重组酶，利用抗性片段两端的FRT序列将抗性标记删除。

Originally posted by scelab at 2010-12-17 09:23:56:

对于pCP20和FLP重组酶，没概念
有相关资料介绍下么

Originally posted by susizheng at 2010-12-17 09:36:42:

Sharan, S. K., L. C. Thomason, et al. (2009). "☆Recombineering: a homologous recombination-based method of genetic engineering." NATURE PROTOCOLS.
Kuhlman, T. E. and E. C. Cox (2010). ...

Originally posted by wwdxx2004 at 2010-12-17 20:59:13:
现在的问题是PCP20丢不了，反敲也没有成功，看文献报道反敲成功几率挺大的，但是到目前为止，没有结果，也不知道那块有问题

Originally posted by 最爱花诗雨 at 2010-12-18 12:33:00:

pCP20在42摄氏度就可以消失的，如果一直去不掉的抗性片段的话，重新做一次重组敲除好了，不麻烦的，这样能排除FRT位点突变的可能了。为什么一定要测序的？不是很浪费吗？电泳跑胶条带没问题就可以了

Originally posted by susizheng at 2010-12-16 21:25:22:
会不会是测序的误差，先反敲除着看看。

Originally posted by wwdxx2004 at 2010-12-18 13:20:50:

重新做一次重组敲除，还是比较麻烦的 ，我们实验室的做了好久都没有敲掉，我是比较幸运，敲除了，但是一直被反敲麻烦着，其实这样还不如重做一次敲除呢，不知道金虫敲除有什么高招？

Originally posted by wwdxx2004 at 2010-12-19 11:12:39:

做了好多次反敲了，都不行，不知道是不是PCP20质粒不行，每次提的PCP20跑胶条带都很弱，转化倒是没什么问题，就是完成不了重组，不知道木虫有什么更好的建议，谢谢！

989437楼: Originally posted by wwdxx2004 at 2010-12-16 20:27:46
请问FRT位点都是一样的吗？我对我敲除后的菌进行测序发现FRT位点处有一个突变 会不会对反敲除有影响呐 谢谢