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wwdxx2004

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】反敲除

请问FRT位点都是一样的吗？我对我敲除后的菌进行测序发现FRT位点处有一个突变 会不会对反敲除有影响呐 谢谢
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1楼 2010-12-16 20:27:46
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susizheng

木虫 (著名写手)
会不会是测序的误差，先反敲除着看看。
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2楼2010-12-16 21:25:22
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scelab

荣誉版主 (文坛精英)
引用回帖:
Originally posted by wwdxx2004 at 2010-12-16 20:27:46:
请问FRT位点都是一样的吗？我对我敲除后的菌进行测序发现FRT位点处有一个突变 会不会对反敲除有影响呐 谢谢

什么叫 反敲除
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3楼2010-12-16 21:44:29
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susizheng

木虫 (著名写手)
★
wwdxx2004(金币+1): 2010-12-17 20:54:13
dhd997(金币+1):good 2010-12-18 13:53:13
引用回帖:
Originally posted by scelab at 2010-12-16 21:44:29:

什么叫 反敲除

反敲除，就是转入抗性片段敲除基因后，转入pCP20表达FLP重组酶，利用抗性片段两端的FRT序列将抗性标记删除。
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4楼2010-12-17 09:19:24
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scelab

荣誉版主 (文坛精英)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2010-12-17 09:19:24:

反敲除，就是转入抗性片段敲除基因后，转入pCP20表达FLP重组酶，利用抗性片段两端的FRT序列将抗性标记删除。

对于pCP20和FLP重组酶，没概念
有相关资料介绍下么
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5楼2010-12-17 09:23:56
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susizheng

木虫 (著名写手)
★ ★
scelab(金币+2):谢谢噢~~~你们看的都是nature级的文章，很强大~~~ 2010-12-17 09:53:33
wwdxx2004(金币+1): 2010-12-17 20:54:21
引用回帖:
Originally posted by scelab at 2010-12-17 09:23:56:

对于pCP20和FLP重组酶，没概念
有相关资料介绍下么

Sharan, S. K., L. C. Thomason, et al. (2009). "☆Recombineering: a homologous recombination-based method of genetic engineering." NATURE PROTOCOLS.
Kuhlman, T. E. and E. C. Cox (2010). "☆Site-specific chromosomal integration of large synthetic constructs." Nucleic Acids Res 38(6): e92.
比较经典的是介绍pKD46这个敲除系统的，暂时没找出来。
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6楼2010-12-17 09:36:42
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最爱花诗雨

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
wwdxx2004(金币+1): 2010-12-17 20:57:23
scelab(金币+3):谢谢交流！:tiger06: 2010-12-17 23:15:56
1楼说的有可能，测序出来结果误差的可能性还是很大的，因为对于Flp/FRT系统，具有良好的稳定性，你的“反敲除”只是一个pCP20的转化热击表达消除抗性基因片段的过程，不麻烦的，如果真的是FRT位点的一个突变，即使抗性基因消除以后，FRT还是会留在序列上，对后期的发酵有没有影响还是不好说的。呵呵~~希望是测序的问题
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7楼2010-12-17 10:06:27
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wwdxx2004

金虫 (正式写手)
现在的问题是PCP20丢不了，反敲也没有成功，看文献报道反敲成功几率挺大的，但是到目前为止，没有结果，也不知道那块有问题
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8楼2010-12-17 20:59:13
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ben1147

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2010-12-17 09:36:42:

Sharan, S. K., L. C. Thomason, et al. (2009). "☆Recombineering: a homologous recombination-based method of genetic engineering." NATURE PROTOCOLS.
Kuhlman, T. E. and E. C. Cox (2010). ...

当年本科毕设用pKD46的时候稀里糊涂就用了，压根什么都不明白。现在想想那时候真是无知者无畏，哈哈
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9楼2010-12-17 22:54:46
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最爱花诗雨

金虫 (正式写手)
wwdxx2004(金币+1): 2010-12-18 13:17:28
wwdxx2004(金币+1): 2010-12-19 11:08:12
引用回帖:
Originally posted by wwdxx2004 at 2010-12-17 20:59:13:
现在的问题是PCP20丢不了，反敲也没有成功，看文献报道反敲成功几率挺大的，但是到目前为止，没有结果，也不知道那块有问题

pCP20在42摄氏度就可以消失的，如果一直去不掉的抗性片段的话，重新做一次重组敲除好了，不麻烦的，这样能排除FRT位点突变的可能了。为什么一定要测序的？不是很浪费吗？电泳跑胶条带没问题就可以了
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10楼2010-12-18 12:33:00
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wwdxx2004

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 最爱花诗雨 at 2010-12-18 12:33:00:

pCP20在42摄氏度就可以消失的，如果一直去不掉的抗性片段的话，重新做一次重组敲除好了，不麻烦的，这样能排除FRT位点突变的可能了。为什么一定要测序的？不是很浪费吗？电泳跑胶条带没问题就可以了

重新做一次重组敲除，还是比较麻烦的 ，我们实验室的做了好久都没有敲掉，我是比较幸运，敲除了，但是一直被反敲麻烦着，其实这样还不如重做一次敲除呢，不知道金虫敲除有什么高招？
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11楼2010-12-18 13:20:50
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wwdxx2004

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2010-12-16 21:25:22:
会不会是测序的误差，先反敲除着看看。

做了好多次反敲了，都不行，不知道是不是PCP20质粒不行，每次提的PCP20跑胶条带都很弱，转化倒是没什么问题，就是完成不了重组，不知道木虫有什么更好的建议，谢谢！
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12楼2010-12-19 11:12:39
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最爱花诗雨

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by wwdxx2004 at 2010-12-18 13:20:50:

重新做一次重组敲除，还是比较麻烦的 ，我们实验室的做了好久都没有敲掉，我是比较幸运，敲除了，但是一直被反敲麻烦着，其实这样还不如重做一次敲除呢，不知道金虫敲除有什么高招？

敲除，对于大肠杆菌，Red同源重组是比较好用的方法了，通常情况下，会出现在重组环节，不过，你为什么一定要反敲除呢？留着那个抗性基因影响很大吗？
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13楼2010-12-20 09:16:28
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最爱花诗雨

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by wwdxx2004 at 2010-12-19 11:12:39:

做了好多次反敲了，都不行，不知道是不是PCP20质粒不行，每次提的PCP20跑胶条带都很弱，转化倒是没什么问题，就是完成不了重组，不知道木虫有什么更好的建议，谢谢！

pCP20质粒，本来浓度就不会很高的，但不会影响转化效率。
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14楼2010-12-20 09:17:48
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xiuluokemo

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
989437楼: Originally posted by wwdxx2004 at 2010-12-16 20:27:46
请问FRT位点都是一样的吗？我对我敲除后的菌进行测序发现FRT位点处有一个突变 会不会对反敲除有影响呐 谢谢

可以跟我讲讲你做red敲除的经验吗？最近做这个，涂板发现板上什么东西都没长！
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15楼2012-08-21 10:48:10
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