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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 双交换筛选问题
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dazhen9527

新虫 (小有名气)

[求助] 双交换筛选问题 已有1人参与

小弟将敲出载体电转到细菌中，利用抗性基因首先筛选到单交换菌株，第二次交换利用sacB敏感性筛选基因敲出突变菌株，现在的情况是只能筛选到单交换菌株，第二次交换就都恢复到野生型菌株了，要敲出的基因不是必须基因，请问各位老师有什么良策，不胜感激！
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justdoit
1楼 2014-07-09 20:41:15
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矜天

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

在中间加一个新的抗性基因

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2楼2014-07-17 12:44:13
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dazhen9527

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 矜天 at 2014-07-17 12:44:13
在中间加一个新的抗性基因

导师不让插入失活，没办法啊
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justdoit
3楼2014-07-17 13:09:11
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矜天

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-07-17 19:54:35
不算插入失活吧，相当于把你的目的基因替换成一个抗性基因

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4楼2014-07-17 17:36:08
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dazhen9527

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 矜天 at 2014-07-17 17:36:08
不算插入失活吧，相当于把你的目的基因替换成一个抗性基因

一样的道理，导师要无缝敲除的，唉
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justdoit
5楼2014-07-21 09:52:17
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矜天

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

我之前做的也是这样，全是回到野生型了，可能这个基因比较重要吧，概率应该很小

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6楼2014-07-21 14:01:03
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dazhen9527

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 矜天 at 2014-07-21 14:01:03
我之前做的也是这样，全是回到野生型了，可能这个基因比较重要吧，概率应该很小

不重要，至少这个领域还没报道有什么重要的作用
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justdoit
7楼2014-07-22 12:15:49
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星空蓝色

新虫 (小有名气)
请问你做出双交换的菌了嘛？我得不到第二次重组的菌，用引物扩增什么都没有

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8楼2017-07-25 20:47:23
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ccf821020

新虫 (小有名气)
你好，问题解决了吗？我现在也遇到问题了，我用的是自杀质粒，单交换获得了，但是双交换死活弄不出。传了10代挑了800多株，只有1株是敏感型，经过验证是回复成了野生型的菌株。双交换敲除菌株这么难敲除吗？
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9楼2017-09-01 09:42:49
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Tosendanin

禁虫
本帖内容被屏蔽
10楼2023-06-04 23:12:25
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