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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 从基因文库中筛选到目的基因后的分析
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hraikeyan

金虫 (小有名气)

[求助] 从基因文库中筛选到目的基因后的分析

各位虫友：本人前段时间从构建好的基因文库中通过功能筛选，筛选到了一株阳性克隆。接着对 测序结果在NCBI中比对，没有能和测出的结果比对上的。因此不知道这段序列编码的是什么酶。
接着把测出的序列用Vector NTI进行ORF分析，如果 将正向测序结果输入（以M13+向开始）显示整个序列被分成很多个ORF,并且最大ORF也只不过500bp，我想这应该不足以编码我的目标蛋白（酰胺酶，实验室克隆出的相同功能的酰胺酶700多bp）；如果将反向的测序结果输入（以M13-向开始）显示大致可以分俩个阅读框，一个1600bp左右，一个有700bp左右。
对于这样的结果我不知道该怎么分析，怎么设计引物克隆出目标编码基因？
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nothing isimpossible
1楼 2013-03-03 22:26:40
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hraikeyan

金虫 (小有名气)
自己顶一下……
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nothing isimpossible
2楼2013-03-04 11:05:33
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hraikeyan

金虫 (小有名气)
3楼2013-03-04 11:06:21
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qqxs

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香。期待你的慷慨解囊。快乐每一天 2013-04-17 09:57:41
先把1600和700的两段分别在大肠杆菌里表达呗，有表型就行，不行的话在把正向的ORF分成两部分在大肠里表达，逐渐减小筛选范围。我想没有捷径。
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4楼2013-03-04 17:47:24
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dmzha

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
hraikeyan: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-03-06 09:05:19
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，鼓励应助，分子生物版块期待你的更多精彩。 2013-04-17 09:57:53
你都知道序列怎么会克隆不出目标编码基因呢？在分析的ORF（个人认为应该是反向测序结果）两端设计引物就行了，然后在大肠杆菌中表达，得到的可溶性蛋白再进行酶学性质鉴定。如果在NCBI中没有比对上，估计是新基因的可能性比较大。PS：就算是新基因，在NCBI数据库中多少还是有同源性不是很高的基因存在。
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5楼2013-03-04 21:34:07
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hraikeyan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by dmzha at 2013-03-04 21:34:07
你都知道序列怎么会克隆不出目标编码基因呢？在分析的ORF（个人认为应该是反向测序结果）两端设计引物就行了，然后在大肠杆菌中表达，得到的可溶性蛋白再进行酶学性质鉴定。如果在NCBI中没有比对上，估计是新基因的 ...

您好，您的意思是我应该按照反向的测序结果设计引物，就是把M13-附近的设计成上游引物，把另一端设计为下游引物。
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nothing isimpossible
6楼2013-03-06 09:05:08
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dmzha

铁杆木虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by hraikeyan at 2013-03-06 09:05:08
您好，您的意思是我应该按照反向的测序结果设计引物，就是把M13-附近的设计成上游引物，把另一端设计为下游引物。...

根据反向序列，在ORF两端设计引物。
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7楼2013-03-07 10:40:08
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duyang1217

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
hraikeyan: 金币+5, ★有帮助 2013-04-17 10:54:18
请问你这两个阅读框是同一相位的吗？如果是同一相位的，更能确定是大的；如果不是一个相位，我的经验一般选择大的，当然需要实验验证。
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用心 耐心 细心的做科研
8楼2013-04-17 09:32:07
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hraikeyan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by duyang1217 at 2013-04-17 09:32:07
请问你这两个阅读框是同一相位的吗？如果是同一相位的，更能确定是大的；如果不是一个相位，我的经验一般选择大的，当然需要实验验证。

请问什么是同一相位，是指在同一位置吗？大的阅读框里包含小的阅读框？
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nothing isimpossible
9楼2013-04-17 11:01:21
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duyang1217

铁虫 (小有名气)
比如atgcgggg，从a开始翻译就是-1相位，从t开始就是+2相位，从第一个g开始就是+3相位；还有从反向翻译的三个相位，如果你是同一个相位翻译出现了两个阅读框，我一般选择最大的，但是想看是不是完整的CDS一般mRNA尽量完整，其实具体分析时还有些可参考的信息。
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用心 耐心 细心的做科研
10楼2013-04-17 14:07:00
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