24小时热门版块排行榜    

查看: 1404  |  回复: 10

hraikeyan

金虫 (小有名气)

[求助] 从基因文库中筛选到目的基因后的分析

各位虫友:本人前段时间从构建好的基因文库中通过功能筛选,筛选到了一株阳性克隆。接着对 测序结果在NCBI中比对,没有能和测出的结果比对上的。因此不知道这段序列编码的是什么酶。
接着把测出的序列用Vector NTI进行ORF分析,如果 将正向测序结果输入(以M13+向开始)显示整个序列被分成很多个ORF,并且最大ORF也只不过500bp,我想这应该不足以编码我的目标蛋白(酰胺酶,实验室克隆出的相同功能的酰胺酶700多bp);如果将反向的测序结果输入(以M13-向开始)显示大致可以分俩个阅读框,一个1600bp左右,一个有700bp左右。
对于这样的结果我不知道该怎么分析,怎么设计引物克隆出目标编码基因?
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

nothing isimpossible
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hraikeyan

金虫 (小有名气)

自己顶一下……
nothing isimpossible
2楼2013-03-04 11:05:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hraikeyan

金虫 (小有名气)

3楼2013-03-04 11:06:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

qqxs

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香。期待你的慷慨解囊。快乐每一天 2013-04-17 09:57:41
先把1600和700的两段分别在大肠杆菌里表达呗,有表型就行,不行的话在把正向的ORF分成两部分在大肠里表达,逐渐减小筛选范围。我想没有捷径。
4楼2013-03-04 17:47:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dmzha

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
hraikeyan: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-03-06 09:05:19
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,鼓励应助,分子生物版块期待你的更多精彩。 2013-04-17 09:57:53
你都知道序列怎么会克隆不出目标编码基因呢?在分析的ORF(个人认为应该是反向测序结果)两端设计引物就行了,然后在大肠杆菌中表达,得到的可溶性蛋白再进行酶学性质鉴定。如果在NCBI中没有比对上,估计是新基因的可能性比较大。PS:就算是新基因,在NCBI数据库中多少还是有同源性不是很高的基因存在。
5楼2013-03-04 21:34:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hraikeyan

金虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by dmzha at 2013-03-04 21:34:07
你都知道序列怎么会克隆不出目标编码基因呢?在分析的ORF(个人认为应该是反向测序结果)两端设计引物就行了,然后在大肠杆菌中表达,得到的可溶性蛋白再进行酶学性质鉴定。如果在NCBI中没有比对上,估计是新基因的 ...

您好,您的意思是我应该按照反向的测序结果设计引物,就是把M13-附近的设计成上游引物,把另一端设计为下游引物。
nothing isimpossible
6楼2013-03-06 09:05:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dmzha

铁杆木虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by hraikeyan at 2013-03-06 09:05:08
您好,您的意思是我应该按照反向的测序结果设计引物,就是把M13-附近的设计成上游引物,把另一端设计为下游引物。...

根据反向序列,在ORF两端设计引物。
7楼2013-03-07 10:40:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

duyang1217

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
hraikeyan: 金币+5, 有帮助 2013-04-17 10:54:18
请问你这两个阅读框是同一相位的吗?如果是同一相位的,更能确定是大的;如果不是一个相位,我的经验一般选择大的,当然需要实验验证。
用心 耐心 细心的做科研
8楼2013-04-17 09:32:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hraikeyan

金虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by duyang1217 at 2013-04-17 09:32:07
请问你这两个阅读框是同一相位的吗?如果是同一相位的,更能确定是大的;如果不是一个相位,我的经验一般选择大的,当然需要实验验证。

请问什么是同一相位,是指在同一位置吗?大的阅读框里包含小的阅读框?
nothing isimpossible
9楼2013-04-17 11:01:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

duyang1217

铁虫 (小有名气)

比如atgcgggg,从a开始翻译就是-1相位,从t开始就是+2相位,从第一个g开始就是+3相位;还有从反向翻译的三个相位,如果你是同一个相位翻译出现了两个阅读框,我一般选择最大的,但是想看是不是完整的CDS一般mRNA尽量完整,其实具体分析时还有些可参考的信息。
用心 耐心 细心的做科研
10楼2013-04-17 14:07:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 hraikeyan 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 2024国社科通讯评审 +13 qsd10086 2024-06-13 23/1150 2024-06-17 22:01 by dickkky
[基金申请] 化学会年会改成一年开一次了? +7 babu2015 2024-06-12 15/750 2024-06-17 20:28 by 落笔画枫
[论文投稿] 论文已接收,但发现修改稿传的是旧版该怎么办? +3 zsq54321 2024-06-15 6/300 2024-06-17 19:45 by wjykycg
[论文投稿] 审稿问题:为什么荧光激发波长和紫外吸收波长差的大? 10+5 sdawege 2024-06-14 10/500 2024-06-17 18:54 by HH-探针
[基金申请] 我标书代码变了 +44 学员NHuqdk 2024-06-16 58/2900 2024-06-17 17:39 by wenfengw83
[有机交流] 苯酚和炔醇反应,mitsunobu反应 5+3 TONGMEIMEI 2024-06-12 9/450 2024-06-17 15:00 by dschong
[找工作] 江西双非一本和四川双一流高校如何选择? 5+8 寒山敲钟 2024-06-12 25/1250 2024-06-16 22:05 by zhaojiang427
[基金申请] 希望今年自己国自然面上项目和老婆青年项目能中! +7 恐龙爸爸 2024-06-14 7/350 2024-06-16 14:48 by redfish105
[基金申请] 博后基金,博管会会提前知道消息吗? +4 yuyiang 2024-06-13 4/200 2024-06-16 11:40 by yangyuzhong4
[基金申请] 博士后创新人才支持计划公示 +9 aishida144 2024-06-14 15/750 2024-06-16 09:52 by msjy
[考博] 上海交大招收材料化学方向科研助理/“申请考核”博士(已招满) +3 灵梦and紫 2024-06-12 4/200 2024-06-15 20:58 by 1822836277
[基金申请] 为什么我的博后基金还在流动站审核中?不会是学院给我卡了吧? +14 王凯12 2024-06-13 26/1300 2024-06-15 15:22 by 好人与坏人
[论文投稿] 投了一篇4区的SCI,审稿人一个拒稿,一个小修,编辑给了大修。 +9 安稳22123 2024-06-13 10/500 2024-06-14 23:45 by jurkat.1640
[考研] 物理化学一对一辅导 +3 林大diao 2024-06-12 5/250 2024-06-14 20:57 by 林大diao
[基金申请] 工材E口JQ有消息了吗 +4 babyduck 2024-06-11 4/200 2024-06-14 17:23 by firepick
[有机交流] ππ堆积会发生在有机溶剂中吗 5+3 zibuyu0420 2024-06-13 4/200 2024-06-14 14:17 by 小肉干
[基金申请] 博士后面上项目状态还是专家评审吗 10+9 Thatcheremu 2024-06-13 55/2750 2024-06-13 21:23 by 乌合麒麟
[硕博家园] 机械研究生如何拿到年薪40+w +13 阿巴阿巴哦哦 2024-06-11 15/750 2024-06-13 15:40 by 113745685
[考博] 博导选择 +3 bing85977 2024-06-12 3/150 2024-06-13 15:34 by 我是邱尧
[论文投稿] with editor日期变更 +3 慎独的小花卷 2024-06-12 8/400 2024-06-13 11:00 by 慎独的小花卷
信息提示
请填处理意见