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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 发酵/表达 » 大肠杆菌BL-21（DE3）是否自带降解外源重组蛋白的蛋白酶？
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厚德求是

金虫 (著名写手)

Ph. D. Prof.

[求助] 大肠杆菌BL-21（DE3）是否自带降解外源重组蛋白的蛋白酶？ 已有1人参与

如题所示，本人想向知情者讨教关于“大肠杆菌BL-21（DE3）是否自带降解外源重组蛋白的蛋白酶”的问题。

事情是这样的，本人所做课题是关于提高某酶蛋白的热稳定性的。因此，在研究其热稳定性的时候，设计测定这个酶在某一温度（例如40℃）下的半衰期。而在实验过程中出现的问题是：酶在40℃下的半衰期太短了，实验数据反应出来的半衰期竟然是1,2分钟；在其最适反应温度30℃下也超不过15min。但这个酶早在实际生产中得到了应用，将同样的带有重组蛋白基因质粒的大肠杆菌BL-21（DE3）做固定化，30℃左右生产可以达到半年时间。

因此我们在思考这个酶在破胞&热处理后的失活原因（破胞后不做热处理的粗酶，酶活还是正常的）。
有一种观点是说大肠杆菌宿主内的蛋白酶将外源重组蛋白降解了，因此我想请教各位的是，大肠杆菌BL-21（DE3）是不是自己带降解外源重组蛋白的蛋白酶，把我的外源重组蛋白水解了？如果不是，那么是什么让这个酶蛋白失活如此之快。
第二种观点是破胞后的蛋白质溶液组分复杂，不同的蛋白质在温度升高的时候相互作用，缠绕，使得目的酶蛋白失活。是否把带有His标签的酶从粗酶液中纯化后热稳定性会有提升？
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1楼 2014-06-12 08:14:42
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厚德求是

金虫 (著名写手)

Ph. D. Prof.
引用回帖:
5楼: Originally posted by 576142326 at 2015-07-08 15:12:17
楼主怎么解决的？...

是这样的：异源表达的蛋白质如果不是体外表达，则需要进行破胞，最常用的就是用超声波破胞。在目的蛋白质本身稳定性较差的情况下如果用水进行重悬破胞，很容易破坏蛋白质的结构，因此导致没有活性。还有就是，用水重悬破胞得到的蛋白质的热稳定性很低，远远低于缓冲液中的蛋白质，我解决的方案就是用pbs缓冲液进行细胞重悬和破胞，之后得到的蛋白质稳定性就好一些了。另外，自己在问题里面描述的那个蛋白质酶的问题应该是不存在的，既然大肠杆菌bl21（de3）已经是一个成熟的宿主了，那么其中的那些限制性酶应该已经被敲出了。问这个问题时候我的实验刚刚展开，什么都不懂。嘿嘿

发自小木虫IOS客户端
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6楼2015-10-14 13:16:08
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huangrui1988

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
厚德求是: 金币+2, ★★★很有帮助, 谢谢你的解答 2014-06-16 09:45:31
厚德求是: 金币+8, ★有帮助, 没有其他人写答案了。。。。。。 2014-07-13 11:15:59
我觉得。。。。只要不是分泌一般蛋白酶的作用好小，你先纯化蛋白试试吧。然后实际生产应该是加了稳定剂什么的。
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2楼2014-06-12 12:45:18
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wangju87c

银虫 (正式写手)
tris缓冲液在破菌的时候可以抑制蛋白酶的活性吧。。
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哥已婚
3楼2014-06-23 16:39:42
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厚德求是

金虫 (著名写手)

Ph. D. Prof.
问题已经解决了，谢谢
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4楼2014-07-12 14:57:37
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