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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于真菌次级代谢产物的生物合成，真菌的基因组未知，怎样找合成酶的基因呢？
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by小宁

木虫 (初入文坛)

[求助] 关于真菌次级代谢产物的生物合成，真菌的基因组未知，怎样找合成酶的基因呢？ 已有2人参与

这个真菌次级代谢产物的合成途径以及关键酶都没有人做过，要先打液相，液质联用找中间代谢物么？可是我想从基因的角度做。大概推测了下，它应该属于聚酮合成途径，聚酮合酶 I 型。我想先找第一步的合成酶基因，应该怎么做呢？
希望大牛们帮助下啊~~十分感激！
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1楼 2014-05-29 11:11:01
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
by小宁(kx444555代发): 金币+2, 鼓励交流 2014-06-03 16:10:44
I型聚酮合酶的基因簇比较大，克隆起来比较费劲。现在真菌的基因组扫描在2万左右吧，建议做个基因组扫描。
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2楼2014-05-30 01:22:52
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by小宁

木虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 克隆大虾 at 2014-05-30 01:22:52
I型聚酮合酶的基因簇比较大，克隆起来比较费劲。现在真菌的基因组扫描在2万左右吧，建议做个基因组扫描。

不好意思，最近才开始做分子的东西，对基因组扫描不懂，是不是和微卫星或SNP有关？做了基因组扫描又有什么用呢？编码这种次级代谢产物的基因也不明确，代谢通路也没有，要怎么来确定合成酶基因呢？谢谢！
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3楼2014-06-02 12:39:32
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-06-03 16:10:48
LZ你现在关键问题是代谢途径不知道，这个代谢的起始底物是什么啊？代谢的终产物你知道是什么物质吗？如果知道终产物完全可以由产物反推酶的。如果不知道产物的话这里加个HPLC其实蛮重要的，只不过标准品要多找些来。
LZ你说它应该属于聚酮合成途径， I 型聚酮合酶。这个有没有可靠的文献作为依据的，还是你自己推测的。如果是有可靠的文献佐证，那你可以去KEGG上找 I 型聚酮合酶，KEGG上好多酶都是附带代谢途径的，说不定别人有过报道或者代谢途径部分确定了的。一旦找到代谢途径，各种酶名字一清楚，到NCBI上找基因就简单了，要是没基因那就看看亲缘关系比较近的菌株中有没有报道。这里最重要的问题还是你的依据充分不充分，依据不充分就有可能你找的酶就和你的代谢产物没关系。
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by小宁
大家相互帮助哈
4楼2014-06-03 12:57:38
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by小宁

木虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-06-03 12:57:38
LZ你现在关键问题是代谢途径不知道，这个代谢的起始底物是什么啊？代谢的终产物你知道是什么物质吗？如果知道终产物完全可以由产物反推酶的。如果不知道产物的话这里加个HPLC其实蛮重要的，只不过标准品要多找些来。 ...

首先谢谢您回复这么多！底物和可能的代谢途径都是猜测的，因为我要做的这个真菌次级代谢产物做的人非常少，所以到现在也没有人研究或者没有人研究出代谢途径中的任何基因或酶或中间代谢物。另外这个真菌是单属单种。我根据同属一类的化合物进行猜测，猜测底物是丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A，终产物就是我研究的这个物质。
我之前的时候做过这种探索，有个物质（C）和我要研究的这个（A）属于同一类化合物，于是用合成C 的基因设计引物，拿到产生A的真菌里边P，后来P出目的条带，经过测序后，在NCBI上进行BlastN，但是没有比对出任何东西，进行BlastX，只是比对出来一些假设性蛋白，然后就不知道该怎么进行实验了。
我现在准备比对一系列C 合成酶的氨基酸序列，找出同源保守区，根据密码子的偏爱性设计简并引物，模板是提取总RNA，以OligdT为引物逆转录成的cDNA；若扩增出基因片段，翻译成氨基酸序列，在数据库中进行比对。不知这种方法可行么？万一还是比对不出来东西该怎么办呢？
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5楼2014-06-03 19:20:59
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by by小宁 at 2014-06-03 19:20:59
首先谢谢您回复这么多！底物和可能的代谢途径都是猜测的，因为我要做的这个真菌次级代谢产物做的人非常少，所以到现在也没有人研究或者没有人研究出代谢途径中的任何基因或酶或中间代谢物。另外这个真菌是单属单种 ...

我晕，你这就是把C的代谢途径硬往A这里嫁接啊。如果你的菌里本身就没有C合成酶那你不是就白做了吗？而且像次级代谢产物合成途径的关键酶都是受到比较严格的诱导调控的，你提RNA的时段说不定这个酶还没转录或者转录已经结束了。mRNA如果太少RT-PCR扩不出来怎么办？
我觉得你还是得先从代谢入手，特别是先测试下你预测的底物对不对，把你开始产次级代谢产物的真菌菌丝收集一些破碎后重悬制备一下胞内粗酶液，然后把乙酰辅酶A或者丙二酰辅酶A和粗酶液混合，也可以再加点ATP做个转化，转化个半个小时检测下你的目标产物有没有生成。如果有产物生成那就好办了。
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大家相互帮助哈
6楼2014-06-03 23:25:41
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by小宁

木虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-06-03 23:25:41
我晕，你这就是把C的代谢途径硬往A这里嫁接啊。如果你的菌里本身就没有C合成酶那你不是就白做了吗？而且像次级代谢产物合成途径的关键酶都是受到比较严格的诱导调控的，你提RNA的时段说不定这个酶还没转录或者转录 ...

谢谢！受益匪浅！
对的，这都只是猜测的。C 和A 属于同一类化合物，而且有共同的母环。根据每类化合物，比如萜类等，底物都是一样的，进行推测的。要是A里边没有C合成酶，确实可能P不出来啊···
至于您说的测试底物对不对，我先做下，有不懂的或者不会的，再来请教您好么···
可否加下您的QQ呢？方便联系···嘿嘿
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7楼2014-06-04 11:09:23
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