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纠结中：pcr产物做模板进行二次pcr一直失败，问题详细描述，求解。 已有1人参与
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用pcr产物做模板进行pcr的时候总是失败。如图所示 本来用基因组做模板，扩增的效率很高，如第一张图，maker与样都是4微。 由于出现非特异扩增，就用胶回收试剂盒回收了一下，回收结果如第二张图，还不错。 为了得到更多的产物，我就用回收产物1微做模板，进行pcr。结果如第三张图，出现的只是涂抹带，没有目的产物。 有人说pcr产物做模板需要稀释，我就分别进行了10倍、50倍、100倍、1000倍和10000倍的稀释，然后进行30个循环的pcr。结果发现就50和100倍的可以进行低效率的pcr反应。如第四张图所示。但是把循环数增加到35个后，又扩增不出产物了。 pcr反应用的是takara的LA Taq酶，体系按说明书上的进行的（增加了mg+的浓度）25ul的体系，pcr程序是 1、94℃ 1min 2c、98℃ 12sec 3c、58℃ 30sec 4c、68℃ 3min 5、 72℃ 5min 6、 4℃ -：- 循环数30和35都试了。 pcr产物胶回收后稀释前的浓度是29.1ng/ul，稀释前后都是用1ul做模板。目标产物为2.7kb。 我非常迷惑，为什么二次pcr的效率这么低，以及，如何才能提高二次pcr的效率。 请各位pcr高手解答。  2014-5-8 大白麻 南农1138 dh2-4 2-4扩增.JPG  2014-5-9 大白麻 南农1138-2dh2-3 2-4 割胶回收.jpg  2014-5-9 左回收产物pcr.JPG  2014-5-10 大白麻2-3pcr产物做模板浓度梯度试验.jpg |
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luwei13566
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建议从基因组上PCR到基因后直接克隆到T载体，先测个序看看是不是你要的序列再说，如果测序正确直接拿重组T载体做模板就能大规模PCR，不需要走二次PCR的路线，你二次PCR做不出来我怀疑你从基因组上P到的序列不一定是你想要的，LA是加A酶，如果连不上T载体的话，那PCR产物就很值得怀疑了，你就拿PCR回收的产物直接测序。 二次PCR风险很大，LZ用的LA也不是什么保真酶，反复PCR很容易导致序列上的点突变，你延伸还3min，30个循环PCR至少2——3h，建议二次PCR 25个循环就足够了，时间再长就不保险了。 至于LZ的PCR体系，我建议用以下步骤二次PCR试试： 1、94℃ 4min 2c、94℃ 30sec 3c、58℃ 40sec 4c、72℃ 3min 5、 72℃ 10min 6、 4℃ -：- 25个循环，模板0.5ul不稀释，50ul体系试试。 二次PCR的模板反复冻融后很容易从末端开始掉碱基，也可能导致你P不出来，建议分装， 二次PCR做检测还好，大规模制备基因不建议做二次PCR |
2楼2014-05-11 01:25:23
3楼2014-06-14 15:53:00
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