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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 蛋白表达，大肠杆菌添加IPTG后菌液渐变澄清
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lyta0

木虫 (小有名气)

[求助] 蛋白表达，大肠杆菌添加IPTG后菌液渐变澄清 已有10人参与

如题，就是一般的GST融合蛋白表达， 将含有含有目的基因的重组质粒转化到表达菌株Rosatta中, 用IPTG诱导表达。最近总是在加入IPTG，降低温度培养后，菌液变澄清，但是37度培养过夜并无细胞裂解，始终找不到原因。不知道大家有没有这方面的经验，谢谢！
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1楼 2014-05-01 16:08:03
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

wangpeng227

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-05-01 20:43:08
如果你确定所有的步骤和试剂都没有问题的话，就可能是因为你表达的蛋白对细菌有毒性。
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3楼2014-05-01 16:20:37
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for5

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-05-03 10:43:37
iptg量加多了，要么是浓度配错了

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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操蛋的XX
2楼2014-05-01 16:16:15
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wangpeng227

木虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by lyta0 at 2014-05-01 16:30:12
以前也做过，没什么问题啊...

你以前也做过这个蛋白的表达吗？还是其他蛋白融合GST标签的表达？
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7楼2014-05-01 17:04:47
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普通回帖

lyta0

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by for5 at 2014-05-01 16:16:15
iptg量加多了，要么是浓度配错了

ITPG 终浓度是100uM, 不高吧
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4楼2014-05-01 16:29:22
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lyta0

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by wangpeng227 at 2014-05-01 16:20:37
如果你确定所有的步骤和试剂都没有问题的话，就可能是因为你表达的蛋白对细菌有毒性。

以前也做过，没什么问题啊
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5楼2014-05-01 16:30:12
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for5

木虫 (正式写手)
★
lyta0(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-05-01 22:42:43
引用回帖:
4楼: Originally posted by lyta0 at 2014-05-01 16:29:22
ITPG 终浓度是100uM, 不高吧...

嗯，是不高，我的意思是母液浓度被人配错了有没有可能，实验室有其它蛋白菌株的话，可以试试其它的菌株是不是加了iptg后也致死

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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操蛋的XX
6楼2014-05-01 16:34:25
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lyta0

木虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by wangpeng227 at 2014-05-01 17:04:47
你以前也做过这个蛋白的表达吗？还是其他蛋白融合GST标签的表达？...

是的，是Rac 蛋白家族
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8楼2014-05-01 17:10:04
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lyta0

木虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by for5 at 2014-05-01 16:34:25
嗯，是不高，我的意思是母液浓度被人配错了有没有可能，实验室有其它蛋白菌株的话，可以试试其它的菌株是不是加了iptg后也致死
...

我觉得母液配错的可能比较低，因为实验室还有其他人再做蛋白纯化，没有出现这种情况
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9楼2014-05-01 17:11:00
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励交流！ 2014-05-03 10:44:28
这事不奇怪。经常出现。
两个方面分析我建议
首先。你若是挑的单克隆。换个单克隆试试。这极有可能是这个单克隆的特性。
然后。如果换了还不行。换个骨架试试。这很有可能是细胞毒性的问题。换一个对leak控制更严格的载体。或者表达系统。

[ 发自小木虫客户端 ]
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10楼2014-05-02 01:33:45
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